Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare i timociti apoptotici e i macrofagi peritoneali e analizzare l’efficienza dell’efferocitosi e il blocco specifico inibitore-mediato di timociti apoptotici engulfment. Questo protocollo ha un’ampia applicazione nella clearance mediata da cellule di altre particelle, tra cui perle artificiali e batteri.
Abstract
L’apoptosi cellulare è un processo naturale e svolge un ruolo critico nello sviluppo embrionale, nella regolazione omeostatica, nell’induzione della tolleranza immunitaria e nella risoluzione dell’infiammazione. L’accumulo di detriti apoptotici nel corpo può innescare risposte infiammatorie croniche che portano a malattie immunitarie sistemiche nel tempo. Alterata clearance delle cellule apoptotiche è stata implicata in una varietà di malattie autoimmuni. La clearance apoptotica è un processo complesso raramente rilevato in condizioni fisiologiche. Si tratta di abbondanti recettori superficiali e molecole di segnalazione. Studiando il processo di clearance delle cellule apoptotiche fornisce meccanismi molecolari penetranti e successive risposte biologiche, che possono portare allo sviluppo di nuove terapie. Qui, descriviamo i protocolli per l’induzione di thymocytes apoptotici, la preparazione di macrofagi peritoneali, e l’analisi della clearance delle cellule apoptotiche da citometria di flusso e microscopia. Tutte le cellule subiscono l’apoptosi in un certo stadio, e molte cellule residenziali e circolanti possono captazione di detriti apoptotici. Pertanto, il protocollo qui descritto può essere utilizzato in molte applicazioni per caratterizzare l’associazione di cellule apoptotiche e l’ingestione da molti altri tipi di cellule.
Introduction
Il nostro corpo genera 1-10 miliardi di cellule apoptotiche su base giornaliera. Tale numero elevato di cellule apoptotiche deve essere cancellato in modo che le risposte immunitarie rimangano quiescenti. Per garantire la clearance delle cellule apoptotiche in modo tempestivo, numerosi tipi di cellule residenti tessuto e cellule circolanti sviluppano meccanismi per inghiottire le cellule apoptotiche1. La regolazione disfunzionale dell’apoptosi è stata implicata nell’insorgenza e nella progressione di varie malattie infiammatorie e autoimmunità2. L’apoptosi svolge anche un ruolo critico nella patogenesi dello sviluppo del cancro e la sua conseguente resistenza ai trattamenti convenzionali3,4. La rimozione delle cellule apoptotiche generalmente promuove una risposta antinfiammatoria, che può essere legata alla tolleranza immunologica5. La violazione della clearance delle cellule apoptotiche spinge l’auto-immunizzazione e contribuisce allo sviluppo di malattie autoimmuni sistemiche sia negli esseri umani che nei topi6.
Quando le cellule subiscono l’apoptosi, espongono la fosfatidilserina (PtdSer) dall’opuscolo interno al foglietto esterno della membrana. PtdSer sarà quindi riconosciuto dai fagociti attraverso i recettori superficiali. Oltre una dozzina di recettori sono stati identificati per riconoscere e/o facilitare l’fiamme di cellule apoptotiche. In generale, ci sono almeno tre tipi di recettori superficiali coinvolti nella clearance delle cellule apoptotiche: recettori tethering, riconoscono le cellule apoptotiche; solletico recettori, avviare engulfment; i recettori di da chaperon, facilitano l’intero processo7. Le tirosina chinasi del recettore TAM (RTK TAM) consistono in TYRO-3, AXL e Mer e sono espresse principalmente da cellule mieloidi del sistema immunitario8. La funzione primaria di TAM RTKs è quella di servire come recettori tethering, facilitando la rimozione fagocitica di cellule apoptotiche e detriti. Il nostro gruppo ha studiato la clearance della cellula apoptotica mediata da TAM nell’impostazione dell’autoimmunità per molti anni. La proteina K-dipendente dall’arresto della crescita proteica specifica 6 (Gas6) e proteina S (Pro) si lega e attiva i recettori Tam9,10. Gas6 è prodotto nel cuore, nei reni e nei polmoni. Pro è prodotto principalmente nel fegato11. TAM riconosce le cellule apoptotiche in modo tale che il N-terminale di Gas6/ProS si lega al PtdSer su una cellula apoptotica e il C-terminal di Gas6/ProS si lega ai recettori TAM che ancorati sulla superficie dei fagociti. Insieme con gli altri recettori, fiamme di cellule apoptotiche si verifica12. Anche se Mer può legarsi sia ai ligandi Pro e Gas6, abbiamo scoperto che Gas6 sembra essere l’unico ligando per la fagocitosi di macrofage mediata da Mer di cellule apoptotiche, che può essere bloccata dall’anticorpo anti-Mer13. I macrofagi sono fagociti professionali. La clearance rapida delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi è importante per l’inibizione dell’infiammazione e delle risposte autoimmuni contro gli antigeni intracellulari. La tirosina chinasi del recettore del Mer è critica per l’fiamme macrofage e la clearance efficiente delle cellule apoptotiche14. Nella milza del topo, Mer si esprime principalmente sulla zona marginale e sui macrofagi corporei tangibili13.
Il protocollo presentato qui descrive un metodo di base per indurre l’apoptosi cellulare e dimostrare modi per misurare il processo e l’efficienza dell’efferocitosi. Questi protocolli possono essere facilmente adattati per studiare l’efferocitosi da altri tipi di cellule in fiamme di cellule apoptotiche di diverse origini.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’apoptosi è un processo di morte cellulare altamente conservato che coinvolge molte cascate di segnale e induce l’espressione proteica, la secrezione e il trasporto. L’apoptosi è spesso associata a cambiamenti della morfologia cellulare17. Le cellule apoptotiche rilasciano attivamente citochines e chemokine che attraggono i fagociti per migrare al sito e avviare il processo di engulfment, un percorso estremamente complesso sotto stretto controllo18. Dall’altro lato, la m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca nel laboratorio di Shao è supportata da Research premio innovativo dal Collegio di medicina e il premio Junior facoltà pilota del dipartimento di medicina interna, Università di Cincinnati e Grant DK K01_095067 da NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
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