Eksperimentell analyse av apoptotisk Thymocyte Oppslukningsprosess av makrofager
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å forberede apoptotisk thymocytes og bukhulen makrofager og analysere effektiviteten av efferocytosis og den spesifikke hemmer-mediert blokkering av apoptotisk thymocytes oppslukningsprosess. Denne protokollen har en bred anvendelse i celle-mediert klaring av andre partikler, inkludert kunstige perler og bakterier.
Abstract
Cell apoptose er en naturlig prosess og spiller en avgjørende rolle i embryoutvikling, homøostatisk regulering, uimottakelig toleranse induksjon, og oppløsning av betennelse. Opphopning av apoptotisk rusk i kroppen kan utløse kroniske inflammatoriske reaksjoner som fører til systemiske autoimmune sykdommer over tid. Nedsatt apoptotisk celle klaring har vært innblandet i en rekke autoimmune sykdommer. Apoptotisk clearance er en kompleks prosess som sjelden oppdages under fysiologiske forhold. Det innebærer rikelig overflate reseptorer og signalering molekyler. Å studere prosessen med apoptotisk celle klaring gir innsiktsfulle molekylære mekanismer og påfølgende biologiske reaksjoner, noe som kan føre til utvikling av nye legemidler. Her beskriver vi protokoller for induksjon av apoptotisk thymocytes, utarbeidelse av bukhulen makrofager, og analyse av apoptotisk celle klaring ved flyt flowcytometri og mikroskopi. Alle celler vil gjennomgå apoptose på et visst Stadium, og mange boliger og sirkulerende celler kan opptaket apoptotisk rusk. Derfor protokollen som er beskrevet her kan brukes i mange programmer for å karakterisere apoptotisk celle binding og inntak av mange andre celletyper.
Introduction
Kroppen vår genererer 1-10 milliarder apoptotisk celler på daglig basis. Et slikt stort antall apoptotisk celler må tømmes på en måte som immunresponser forblir Quiescent. For å sikre clearance av apoptotisk celler på en riktig måte, mange typer vev bosatt celler og sirkulerende celler utvikle mekanismer for å sluker apoptotisk celler1. Dysfunksjonelle regulering av apoptose har vært innblandet i utbruddet og progresjon av ulike inflammatorisk sykdom og autoimmunitet2. Apoptose spiller også en avgjørende rolle i patogenesen av kreftutvikling og dens påfølgende motstand mot konvensjonelle behandlinger3,4. Fjerning av apoptotisk celler generelt fremmer en anti-inflammatorisk respons, som kan være knyttet til immunologiske toleranse5. Forstyrrelse av apoptotisk celle klaring kjører selv-immunisering og bidrar til utvikling av systemiske autoimmune sykdommer hos både mennesker og mus6.
Når cellene gjennomgår apoptose, utsetter de fosfatidylserin (PtdSer) fra det indre pakningsvedlegget til den ytre pakningsvedlegget til membranen. PtdSer vil da bli gjenkjent av phagocytes gjennom overflate reseptorer. Over et dusin reseptorer har blitt identifisert å anerkjenne og/eller tilrettelegge for oppslukningsprosess av apoptotisk celler. Generelt er det minst tre typer overflate reseptorer som er involvert i apoptotisk celle klaring: tethering reseptorer, gjenkjenne apoptotisk celler; kile reseptorer, initiere oppslukningsprosess; passe reseptorer, lette hele prosessen7. TAM reseptor tyrosin kinaser (TAM RTKs) består av Tyro-3, enXL, og Mer og er primært uttrykt ved myelogen celler i immunsystemet8. Den primære funksjon TAM RTKs er å tjene som tethering reseptorer, tilrettelegging for phagocytic fjerning av apoptotisk celler og rusk. Vår gruppe har studert TAM mediert apoptotisk celle klaring i innstillingen av autoimmunitet i mange år. Vitamin K-avhengige protein vekst arrest bestemt protein 6 (Gas6) og protein S (proffene) binder seg til og aktiverer TAM reseptorer9,10. Gas6 produseres i hjerte, nyrer og lunger. ProS er hovedsakelig produsert i leveren11. TAM anerkjenner av apoptotisk celler på en slik måte at N-terminalen av Gas6/ProS binder seg til PtdSer på en apoptotisk celle og C-terminal av Gas6/ProS binder seg til TAM-reseptorer som forankret på overflaten av phagocytes. Sammen med de andre reseptorene, oppslukningsprosess av apoptotisk celler forekommer12. Selv om mer kan binde til både ligander ProS og Gas6, fant vi ut at Gas6 synes å være den eneste ligand for mer-mediert macrophage fagocytose av apoptotisk celler, som kan blokkeres av anti-mer antistoff13. Makrofager er profesjonelle phagocytes. Rask clearance av apoptotisk celler av makrofager er viktig for hemming av betennelse og autoimmune responser mot intracellulære antigener. Mer reseptor tyrosin kinase er avgjørende for macrophage oppslukningsprosess og effektiv clearance av apoptotisk celler14. I mus milt, mer hovedsakelig uttrykker på marginale sonen og konkrete kroppen makrofager13.
Protokollen som presenteres her beskriver en grunnleggende metode for å indusere celle apoptose og demonstrere måter å måleprosessen og effektiviteten av efferocytosis. Disse protokollene kan lett tilpasses til å studere efferocytosis av andre celletyper i oppslukningsprosess av apoptotisk celler av ulik opprinnelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptose er en svært bevart celle død prosess som involverer mange signal kaskader og induserer protein uttrykk, sekresjon og transport. Apoptose er ofte forbundet med cellulære morfologi endringer17. Apoptotisk celler aktivt løslate cytokiner og chemokiner som tiltrekker phagocytes å migrere til området og starte prosessen med oppslukningsprosess, en ekstremt kompleks vei under stram kontroll18. På den annen side, nekrotisk celle død utgivelser faresignaler som utl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Shao Lab er støttet av forskning innovative Award fra College of Medicine og Junior fakultet pilot Award fra Institutt for indremedisin, Universitetet i Cincinnati og gi DK K01_095067 fra NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
