Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour préparer les thymocytes apoptotiques et les macrophages péritonéaux et analyser l’efficacité de l’effocytose et le blocage spécifique par inhibiteur de l’engloutement des thymocytes apoptotiques. Ce protocole a une application large dans le dégagement de cellules-médiation d’autres particules y compris les billes artificielles et les bactéries.

Résumé

L’apoptose cellulaire est un processus naturel et joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire, la régulation homéostatique, l’induction de la tolérance immunitaire et la résolution de l’inflammation. L’accumulation de débris apoptotiques dans le corps peut déclencher des réactions inflammatoires chroniques qui conduisent à des maladies auto-immunes systémiques au fil du temps. Une altération de la clairance des cellules apoptotiques a été impliquée dans une variété de maladies auto-immunes. La clairance apoptotique est un processus complexe rarement détecté dans des conditions physiologiques. Il implique des récepteurs de surface abondants et des molécules de signalisation. L’étude du processus de clairance des cellules apoptotiques fournit des mécanismes moléculaires perspicaces et des réponses biologiques ultérieures, ce qui peut conduire au développement de nouvelles thérapies. Ici, nous décrivons les protocoles pour l’induction des thymocytes apoptotiques, la préparation des macrophages péritonéaux, et l’analyse de la clairance des cellules apoptotiques par cytométrie en flux et microscopie. Toutes les cellules seront soumises à une apoptose à un certain stade, et de nombreuses cellules résidentielles et circulantes peuvent absorber les débris apoptotiques. Par conséquent, le protocole décrit ici peut être utilisé dans de nombreuses applications pour caractériser la liaison de cellules apoptotiques et l’ingestion par de nombreux autres types de cellules.

Introduction

Notre corps génère 1-10 milliards de cellules apoptotiques sur une base quotidienne. Un tel grand nombre de cellules apoptotiques doit être effacé de manière à ce que les réponses immunitaires demeurent quiescentes. Pour assurer le dégagement des cellules apoptotiques en temps opportun, de nombreux types de cellules résidentes de tissu et de cellules circulantes développent des mécanismes pour engloutir les cellules apoptotiques¹. La régulation dysfonctionnelle de l’apoptose a été impliquée dans l’apparition et la progression de diverses maladies inflammatoires et de l’auto-immunité². L’apoptose joue également un rôle cr....

Protocole

Des souris expérimentales ont été élevées et maintenues dans notre colonie de souris. Tous les travaux sur les animaux ont été menés conformément aux directives du Comité institutionnel de l’Université de Cincinnati sur les soins et l’utilisation des animaux (IACUC).

1. préparation des thymocytes apoptotiques étiquetés CFSE

1. Euthanasier deux souris C57/B6 naïves par CO₂ inhalation pendant 10 min et disséquer pour ouvrir la cavité thoracique, enlever (retirer) le thymus avec des pinces fines incurvées dans la boîte de Petri de culture tissulaire contenant 10 ml de milieu RPMI1640.
2. Obtenir une suspension à une se....

Résultats

Analyse de l’engloutement de thymocytes apoptotiques par le macrophage péritonéal. Les macrophages péritonéaux et les cellules apoptotiques ont été préparés et co-cultivés comme décrit dans le protocole. Les macrophages ont été détachés et colorés avec l’anticorps anti-CD11b conjugué au PE pendant 20 min sur la glace. Les macrophages ont ensuite été lavés et transformés dans un cytomètre à flux. Comme on le voit, il n’y a pas de macrophages positif CFSE dans le quadrant inférieur droit quand aucune cellu.......

Discussion

L’apoptose est un processus de mort cellulaire hautement conservé qui implique de nombreuses cascades de signaux et induit l’expression des protéines, la sécrétion et le transport. L’apoptose est souvent associée à des changements de morphologie cellulaire¹⁷. Les cellules apoptotiques libèrent activement des cytokines et des chimiokines qui attirent les phagocytes pour migrer vers le site et initier le processus d’engloutement, une voie extrêmement complexe sous contrôle serré^18<.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon d’abrasion	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R& D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
Tubes FACS	BD Biosciences	352017
Lames givrées	Fisher Scientific	12-552-343
Sérum de cheval (inactivé par la chaleur)	Invitrogen	26050088
Lidocaïne	Sigma-Aldrich	L-5647	Préparez un tampon à 1 % dans 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Ajouter 214,3 ml de DMSO dans 100mg pour faire 1mM de solution de stockage
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Préparer un tampon de thioglycolate à 3 % dans 1´ ; PBS, autoclavé et conservé à l’obscurité pendant 3 mois.