Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor te bereiden apoptotic thymocyten en buikvlies macrofagen en analyseren van de efficiëntie van efferocytosis en de specifieke remmer-gemedieerde blokkering van apoptotic thymocyten overspoeling. Dit protocol heeft een brede toepassing in cel-gemedieerde ontruiming van andere deeltjes met inbegrip van kunstmatige kralen en bacteriën.
Abstract
De cel apoptosis is een natuurlijk proces en speelt een kritieke rol in embryonale ontwikkeling, homeostatische regelgeving, immune tolerantie inductie, en resolutie van ontsteking. Accumulatie van apoptotic puin in het lichaam kan leiden tot chronische inflammatoire reacties die leiden tot systemische auto-immuunziekten in de tijd. Verminderde apoptotic cel klaring is betrokken bij een verscheidenheid van auto-immuunziekten. Apoptotic klaring is een complex proces zelden ontdekt onder fysiologische omstandigheden. Het gaat om overvloedig oppervlak receptoren en signalering moleculen. Het bestuderen van het proces van apoptotic cel ontruiming biedt inzichtelijke moleculaire mechanismen en de daaropvolgende biologische reacties, die kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Hier beschrijven we protocollen voor de inductie van apoptotic thymocyten, de voorbereiding van het buikvlies macrofagen, en de analyse van apoptotic cel ontruiming doorstroming Cytometry en microscopie. Alle cellen zullen apoptose ondergaan in een bepaald stadium, en veel residentiële en circulerende cellen kunnen opname apoptotic puin. Daarom, het protocol hier beschreven kan worden gebruikt in vele toepassingen te karakteriseren apoptotic cel binding en inname door vele andere soorten cellen.
Introduction
Ons lichaam genereert 1-10 miljard apoptotic cellen op een dagelijkse basis. Zulk een groot aantal apoptotic cellen moet op een bepaalde manier worden ontruimd dat de immune reacties rustig blijven. Om de goedkeuring van apoptotic cellen tijdig te verzekeren, ontwikkelen talrijke types van weefsel ingezetene cellen en circulerende cellen mechanismen om apoptotic cellen over te spoelen1. Disfunctionele regulering van apoptosis is betrokken bij het begin en de progressie van verschillende inflammatoire aandoeningen en autoimmuniteit2. Apoptosis speelt ook een kritieke rol in de pathogenese van kankerontwikkeling en zijn verdere weerstand tegen conventionele behandelingen3,4. Verwijdering van apoptotic cellen bevordert in het algemeen een anti-inflammatoire reactie, die kan worden gekoppeld aan immunologische tolerantie5. Verstoring van apoptotic Cell klaring drives zelf-immunisatie en draagt bij tot de ontwikkeling van systemische auto-immuunziekten in zowel mensen als muizen6.
Wanneer de cellen apoptosis ondergaan, stellen zij de fosfatidylserine (PtdSer) van de binnen folder aan de buiten folder van het membraan bloot. PtdSer zal dan door fagocyten door oppervlakte receptoren worden erkend. Meer dan een dozijn receptoren zijn geïdentificeerd te herkennen en/of te vergemakkelijken de overspoeling van apoptotic cellen. In het algemeen zijn er ten minste drie soorten oppervlakte-receptoren die betrokken zijn bij de apoptotic cel klaring: Tethering receptoren, herkennen apoptotic cellen; kietelen receptoren, initiëren overspoeling; chaperoning receptoren, vergemakkelijken het hele proces7. TAM receptor tyrosine kinases (TAM RTKs) bestaan uit Tyro-3, AXL, en Mer en worden voornamelijk uitgedrukt door myeloïde cellen van het immuunsysteem8. De primaire functie van TAM RTKs is om te dienen als Tethering receptoren, het vergemakkelijken van de fagocyterende verwijdering van apoptotic cellen en puin. Onze groep heeft gestudeerd TAM gemedieerde apoptotic Cell klaring in de setting van de autoimmuniteit voor vele jaren. De vitamine K-afhankelijke eiwit de groeiarrestatie specifieke proteïne 6 (Gas6) en proteïne S (ProS) bindt aan en activeert de receptoren van TAM9,10. Gas6 wordt geproduceerd in het hart, nieren, en de longen. ProS wordt hoofdzakelijk geproduceerd in lever11. TAM erkent van apoptotic cellen op een zodanige wijze dat de N-terminal van Gas6/ProS bindt aan de PtdSer op een apoptotic cel en de C-terminal van Gas6/ProS bindt aan TAM-receptoren die verankerd op het oppervlak van fagocyten. Samen met de andere receptoren, overspoeling van apoptotic cellen komt12. Hoewel Mer kan binden aan zowel de ligands ProS en Gas6, vonden we dat Gas6 lijkt te zijn de enige ligand voor Mer-gemedieerde macrofagen fagocytose van apoptotic cellen, die kunnen worden geblokkeerd door anti-Mer antilichaam13. Macrofagen zijn professionele fagocyten. Snelle ontruiming van apoptotic cellen door macrofagen is belangrijk voor de remming van ontstekingen en auto-immune reacties tegen intracellulaire antigenen. Mer receptor tyrosine kinase is van cruciaal belang voor de inspoeling van de macrofagen en efficiënte klaring van apoptotic cellen14. In muis milt, Mer voornamelijk uitdrukt op de marginale zone en tastbare lichaam macrofagen13.
Het hier voorgestelde protocol beschrijft een basismethode om cel apoptosis te veroorzaken en manieren aan te tonen om het proces en de efficiency van efferocytosis te meten. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan studie efferocytosis door andere cel types in het overspoelen van apoptotic cellen van verschillende oorsprong.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptosis is een hoogst behouden celdood proces dat vele signaalcascades impliceert en proteïne uitdrukking, afscheiding, en vervoer veroorzaakt. Apoptosis wordt vaak geassocieerd met cellulaire morfologie veranderingen17. Apoptotic cellen actief vrijgeven cytokines en chemokines die aantrekken fagocyten om te migreren naar de site en initiëren van het proces van overspoeling, een uiterst complexe route onder strakke controle18. Aan de andere kant, necrotic Cell Death rel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in de Shao Lab wordt ondersteund door onderzoek innovatieve Award van het College of Medicine en de Junior Faculty pilot Award van het ministerie van interne geneeskunde, Universiteit van Cincinnati en Grant DK K01_095067 van NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
