एपोप्टोटिक थाइमोसाइट का प्रायोगिक विश्लेषण मैक्रोफेज द्वारा निगण
Summary
यहाँ, हम अपोप्तोटिक थाइमोसाइट्स और पेरिटोनियल मैक्रोफेज तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और एफिरोसाइटोसिस की दक्षता का विश्लेषण और अपोप्तोटिक thymocytes निगमित की विशिष्ट अवरोध करनेवाला-मध्यस्थता अवरुद्ध । इस प्रोटोकॉल में कृत्रिम मोतियों और बैक्टीरिया सहित अन्य कणों के सेल-मीडिरेटेड क्लीयरेंस में एक व्यापक अनुप्रयोग है ।
Abstract
सेल apoptosis एक प्राकृतिक प्रक्रिया है और भ्रूण के विकास, समस्थैतिक विनियमन, प्रतिरक्षा सहिष्णुता प्रेरण, और सूजन के समाधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । शरीर में अपोप्तोटिक मलबे का संचय पुरानी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं कि समय के साथ प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए नेतृत्व को ट्रिगर कर सकते हैं । बिगड़ा अपोप्तोटिक सेल निकासी कई स्व-प्रतिरक्षित रोगों में फंसाया गया है । एपोटोटिक निकासी एक जटिल प्रक्रिया है जो शायद ही कभी शारीरिक परिस्थितियों में पाई जाती है । यह प्रचुर मात्रा में सतह रिसेप्टर्स और संकेत अणुओं शामिल है । अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस की प्रक्रिया का अध्ययन व्यावहारिक आणविक तंत्र और बाद में जैविक प्रतिक्रियाओं, जो नए चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं प्रदान करता है । यहाँ, हम अपोप्तोटिक thymocytes, पेरिटोनियल मैक्रोफेज की तैयारी, और प्रवाह कोशिका मिति और माइक्रोस्कोपी द्वारा अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस के विश्लेषण के प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । सभी कोशिकाओं को एक निश्चित स्तर पर apoptosis गुजरना होगा, और कई आवासीय और परिसंचारी कोशिकाओं apoptosis मलबे तेज कर सकते हैं । इसलिए, प्रोटोकॉल यहां वर्णित कई अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता अपोप्तोटिक सेल बाइंडिंग और घूस कई अंय प्रकार के सेल की विशेषता है ।
Introduction
हमारा शरीर एक दैनिक आधार पर 1-10 अरब अपोप्तोटिक कोशिकाओं को उत्पंन करता है । इतनी बड़ी संख्या में अपोप्तोटिक कोशिकाओं को एक तरह से साफ किया जाना चाहिए कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं शांत रहते हैं । एक आवधिक रूप में अपोप्तोटिक कोशिकाओं की मंजूरी सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक निवासी कोशिकाओं और परिसंचारी कोशिकाओं के कई प्रकार के अपोप्तोटिक कोशिकाओं को निगलकरने के लिए तंत्र विकसित. Apoptosis के बेकार विनियमन शुरू और विभिंन भड़काऊ रोग और autoimmunity2की प्रगति में फंसाया गया है । Apoptosis भी कैंसर के विकास के रोगजनन और पारंपरिक उपचार3,4के लिए इसके बाद प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । अपोप्तोटिक कोशिकाओं को हटाने आम तौर पर एक विरोधी भड़काऊ प्रतिक्रिया है, जो प्रतिरक्षाविज्ञानी सहिष्णुता5से जोड़ा जा सकता है को बढ़ावा देता है । अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस की अशांति आत्म प्रतिरक्षण ड्राइव और मानव और चूहों दोनों में प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोग के विकास में योगदान देता है।
जब कोशिकाओं apoptosis से गुजरना, वे झिल्ली के बाहरी पत्रक के लिए भीतरी पत्रक से फॉसटाइडिलोसेरिन (PtdSer) का पर्दाफाश । Ptdser तो सतह रिसेप्टर्स के माध्यम से फ़ैगोसाइट द्वारा मांयता प्राप्त हो जाएगा । एक दर्जन से अधिक रिसेप्टर्स को पहचान करने के लिए पहचान की गई है और/या अपोप्तोटिक कोशिकाओं की निगदीकरण की सुविधा । सामांय में, वहां सतह रिसेप्टर्स अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस में शामिल के कम से तीन प्रकार के होते हैं: tethering रिसेप्टर्स, अपोप्तोटिक कोशिकाओं को पहचान; रिसेप्टर्स गुदगुदी, आरंभ निगलन; chaperoning रिसेप्टर्स, पूरी प्रक्रिया7की सुविधा । टैम रिसेप्टर tyrosine kinases (टैम rtks) टीyro-3, एकएक्स्ट्रा लार्ज, और एमईआर से मिलकर बनता है और मुख्य रूप से प्रतिरक्षा प्रणाली8के माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे हैं । ताम rtks का प्राथमिक समारोह tethering रिसेप्टर्स के रूप में सेवा करने के लिए है, अपोप्तोटिक कोशिकाओं और मलबे के भक्षकाण्विक हटाने की सुविधा. हमारे समूह ने कई वर्षों तक ऑटोइम्युनिटी की सेटिंग में टैम मीडिएटेड एपीऑप्टोटिक सेल क्लीयरेंस का अध्ययन किया है । विटामिन K-निर्भर प्रोटीन विकास गिरफ्तारी विशिष्ट प्रोटीन 6 (Gas6) और प्रोटीन एस (पेशेवरों) के लिए बांध और टैम रिसेप्टर्स9,10सक्रिय करता है । Gas6 दिल, गुर्दे, और फेफड़ों में उत्पादित है । पेशेवरों मुख्य रूप से11जिगर में उत्पादित है । टैम अपोप्तोटिक कोशिकाओं को इस तरह से पहचानता है कि एन टर्मिनल Gas6/पेशेवरों के एक अपोप्तोटिक सेल पर ptdser के लिए बांध और Gas6 के सी टर्मिनल/ एक साथ अन्य रिसेप्टर्स के साथ, अपोप्तोटिक कोशिकाओं की निगदीकरण12होता है. हालांकि मेर दोनों लिगन्डों पेशेवरों और Gas6 के लिए बाध्य कर सकते हैं, हमने पाया है कि Gas6 के लिए एकमात्र लिगामेंट होना प्रतीत होता है अपोप्तोटिक कोशिकाओं, जो विरोधी mer एंटीबॉडी13द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है की मध्यस्थता मैक्रोफेज phagocytosis । मैक्रोफेज प्रोफेशनल फैगोसाइट्स होते हैं । मैक्रोफेज द्वारा अपोप्तोटिक कोशिकाओं की तेजी से निकासी सूजन और intracellular एंटीजन के खिलाफ स्व-प्रतिरक्षित प्रतिक्रियाओं का निषेध के लिए महत्वपूर्ण है । मेर रिसेप्टर tyrosine काइनेज मैक्रोफेज निगल और अपोप्तोटिक कोशिकाओं के कुशल क्लीयरेंस के लिए महत्वपूर्ण है14. माउस तिल्ली में, मेर मुख्य रूप से सीमांत क्षेत्र और मूर्त शरीर मैक्रोफेज13पर व्यक्त करता है ।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कोशिका apoptosis को प्रेरित करने के लिए एक बुनियादी विधि का वर्णन करता है और प्रक्रिया और efferocytosis की दक्षता को मापने के तरीकों का प्रदर्शन । इन प्रोटोकॉलों को विभिन्न मूल के अपोप्तोटिक कोशिकाओं के निगन में अन्य कोशिका प्रकारों द्वारा efferocytosis का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptosis एक उच्च संरक्षित कोशिका मृत्यु प्रक्रिया है कि कई संकेत cascades शामिल है और प्रोटीन अभिव्यक्ति, स्राव लाती है, और परिवहन । Apoptosis अक्सर सेलुलर आकारिकी परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है17. Apoptotic कोशिकाओं क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Shao लैब में अनुसंधान चिकित्सा के कॉलेज से अनुसंधान अभिनव पुरस्कार और आंतरिक चिकित्सा, सिनसिनाटी विश्वविद्यालय और अनुदान डीके K01_095067 से NIDDK/NIH के विभाग से कनिष्ठ संकाय पायलट पुरस्कार से समर्थित है ।
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
