Experimentell analys av apoptotiska thymocyte Engulfment av macrophages
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda apoptotiska tymocyter och peritonealdialys makro Fager och analysera effektiviteten av efferocytosis och den specifika inhibitor-medierad blockering av apoptotiska tymocyter engulfment. Detta protokoll har en bred tillämpning i cell-medierad clearance av andra partiklar, inklusive konstgjorda pärlor och bakterier.
Abstract
Cell apoptos är en naturlig process och spelar en kritisk roll i embryonal utveckling, homeostatiska reglering, immun tolerans induktion, och upplösning av inflammation. Ansamling av apoptotiska skräp i kroppen kan utlösa kroniska inflammatoriska reaktioner som leder till systemiska autoimmuna sjukdomar över tid. Nedsatt apoptotiska cell clearance har varit inblandad i en mängd olika autoimmuna sjukdomar. Apoptotiska clearance är en komplicerad process som sällan upptäcks under fysiologiska förhållanden. Det innebär rikliga ytreceptorer och signal molekyler. Att studera processen för apoptotiska cell clearance ger insiktsfulla molekyl ära mekanismer och efterföljande biologiska svar, vilket kan leda till utveckling av nya terapier. Här beskriver vi protokoll för induktion av apoptotiska tymocyter, beredning av peritonealdialys makro Fager, och analys av apoptotiska cell clearance av flödescytometri och mikroskopi. Alla celler kommer att genomgå apoptos vid ett visst Stadium, och många bostäder och cirkulerande celler kan upptag apoptotiska skräp. Därför kan det protokoll som beskrivs här användas i många program för att karakterisera apoptotiska cell bindning och intag av många andra cell typer.
Introduction
Vår kropp genererar 1-10 miljarder apoptotiska celler på daglig basis. Ett sådant stort antal apoptotiska celler måste rensas på ett sätt som immun svaret förblir quiescent. För att säkerställa clearance av apoptotiska celler i tid, många typer av vävnad bosatta celler och cirkulerande celler utveckla mekanismer för att uppsluka apoptotiska celler1. Dysfunktionell reglering av apoptos har varit inblandad i uppkomsten och progressionen av olika inflammatoriska sjukdomar och autoimmunitet2. Apoptos spelar också en avgörande roll i patogenesen av cancer utveckling och dess efterföljande motstånd mot konventionella behandlingar3,4. Avlägsnande av apoptotiska celler främjar i allmänhet ett antiinflammatoriskt svar, som kan kopplas till immunologisk tolerans5. Störning av apoptotiska cell clearance driver själv immunisering och bidrar till utvecklingen av systemiska autoimmuna sjukdomar hos både människor och möss6.
När cellerna genomgår apoptos, de utsätter fosfatidylserin (PtdSer) från den inre broschyren till den yttre broschyren av membranet. PtdSer kommer sedan att kännas igen av fagocyter genom ytan receptorer. Över ett dussin receptorer har identifierats för att känna igen och/eller under lätta omvälvning av apoptotiska celler. I allmänhet finns det minst tre typer av ytreceptorer involverade i apoptotiska cell clearance: tjudra receptorer, erkänna apoptotiska celler; kittlande receptorer, initiera engulfment; chaperoning receptorer, under lätta hela processen7. TAM-receptortyrosinkinaser (TAM RTKs) består av TYRO-3, AXL, och Mer och uttrycks främst av myeloida celler i immun systemet8. Den primära funktionen för TAM RTKs är att fungera som tjudra receptorer, under lätta fagocytos avlägsnande av apoptotiska celler och skräp. Vår grupp har studerat TAM medierad apoptotiska cell clearance i fast ställandet av autoimmunitet i många år. Vitamin K-beroende protein tillväxt arrest specifikt protein 6 (Gas6) och protein S (ProS) binder till och aktiverar Tam-receptorer9,10. Gas6 produceras i hjärta, njurar och lungor. ProS produceras främst i levern11. TAM känner igen av apoptotiska celler på ett sådant sätt att N-terminalen av Gas6/Pros binder till ptdser på en apoptotiska cell och C-terminalen av Gas6/ProS binder till TAM-receptorer som förankrat på ytan av fagocyter. Tillsammans med de andra receptorerna, är omvälvning av apoptotiska celler12. Även om mer kan binda till både ligander ProS och Gas6, fann vi att Gas6 verkar vara den enda ligand för mer-medierad makrofag fagocytos av apoptotiska celler, som kan blockeras av anti-mer anti kropp13. Makro Fager är professionella fagocyter. Snabb Eli mineringar av apoptotiska celler av makro Fager är viktigt för hämning av inflammation och autoimmuna reaktioner mot intracellulära antigener. Mer receptor tyrosinkinas är kritisk för makro Fager omvälvning och effektivt clearance av apoptotiska celler14. I mus mjälte, uttrycker mer främst på marginella zonen och materiella kroppen makro Fager13.
Det protokoll som presenteras här beskriver en grundläggande metod för att inducera cell apoptos och Visa sätt att mäta processen och effektiviteten av efferocytos. Dessa protokoll kan lätt anpassas för att studera efferocytosis av andra cell typer i omvälvning av apoptotiska celler av olika ursprung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptos är en mycket bevarade celldöd process som involverar många signalkaskader och inducerar protein uttryck, sekretion och transport. Apoptos är ofta förknippat med cellulära morfologi förändringar17. Apoptotiska celler släpper aktivt cytokiner och chemokiner som lockar fagocyter att migrera till platsen och initiera processen för engulfment, en extremt komplex väg under snäva kontroll18. Å andra sidan, nekrotisk celldöd frigör farosignaler som utlöser i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Shao Lab stöds av forskning innovativa utmärkelse från College of Medicine och Junior fakulteten pilot Award från Institutionen för intern medicin, University of Cincinnati och Grant DK K01_095067 från NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
