Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi
Summary
Burada, apoptotik tirositler ve periton makrofajlar hazırlamak ve effersitoz verimliliğini ve apoptotik tirositlerin özel inhibitörü-aracılı engellemesini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol yapay boncuk ve bakteri dahil olmak üzere diğer parçacıklar hücre aracılı boşluk geniş bir uygulama vardır.
Abstract
Hücre apoptozis doğal bir süreçtir ve embriyonik gelişim, homeostatik düzenleme, bağışıklık toleransı indüksiyon ve inflamasyonun çözünürlüğü önemli bir rol oynar. Vücutta apoptotik enkaz birikimi zaman içinde sistemik otoimmün hastalıklara yol açan kronik inflamatuar tepkiler tetikleyebilir. Engelli apoptotik hücre boşluğu, çeşitli otoimmün hastalıklarda karışmıştır. Apoptotik boşluk fizyolojik koşullarda nadiren algılanan karmaşık bir süreçtir. Bu bol yüzey reseptörleri ve sinyalizasyon molekülleri içerir. Apoptotik hücre boşluğu sürecini incelemek, yeni terapilerinin gelişmesine yol açabilecek anlayışlı moleküler mekanizmalar ve sonraki biyolojik tepkiler sağlar. Burada, apoptotik tirositlerin indüksiyonu, periton makrofajların hazırlanması, ve osiyometri ve mikroskopi ile apoptotik hücre boşluğu analizi için protokoller açıklanmaktadır. Tüm hücreler belirli bir aşamada apoptozis geçecek, ve birçok konut ve dolaşım hücreleri apoptotik enkaz alabilir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol birçok uygulamada apoptotik hücre bağlama ve diğer birçok hücre türleri tarafından yutulması karakterize etmek için kullanılabilir.
Introduction
Vücudumuzun günlük olarak 1-10 milyar apoptotik hücreler üretir. Apoptotik hücrelerin böyle çok sayıda bağışıklık tepkiler sessiz kalır bir şekilde temizlenmelidir. Apoptotik hücrelerin zamanında temizlenmesini sağlamak için, çok sayıda doku yerleşik hücresi ve dolaşım hücresi apoptotik hücreleri yutan mekanizmalar geliştirir1. Çeşitli enflamatuar hastalığın ve otoimmün2‘ nin başlangıcı ve progresyonunda apoptozin işlevsiz olarak düzenlenmesi ortaya çıkarılmıştır. Apoptosis Ayrıca kanser gelişiminin patogenezinde ve Konvansiyonel tedavilere karşı sonraki direncinde kritik bir rol oynamaktadır3,4. Apoptotik hücrelerin kaldırılması genellikle immünolojik tolerans5ile bağlantılı olabilecek bir anti-inflamatuar yanıtı teşvik eder. Apoptotik hücre boşluklarının bozulması kendi kendine immünizasyonu tahrik ediyor ve hem insanlar hem de fareler6‘ da sistemik otoimmün hastalıkların gelişmesine katkıda bulunur.
Hücreler apoptozis geçmesi, onlar fosfatidilserine maruz (PtdSer) membranın dış broşür için iç broşür. Ptdser daha sonra yüzey reseptörleri ile fagositler tarafından tanınacaktır. Bir düzine reseptörlerin üzerinde tanımak ve/veya apoptotik hücrelerin yutulma kolaylaştırmak için tespit edilmiştir. Genel olarak, apoptotik hücre boşlukunda yer alan en az üç tip yüzey reseptörü vardır: reseptörleri tethering, apoptotik hücreleri tanımak; gıdıklamalar reseptörleri, başlatmak engulfment; reseptörleri, tüm süreci kolaylaştırmak7. TAM reseptör Tirozin kinazlar (TAM RTKs) TYRO-3, AXL ve Mer oluşur ve öncelikle bağışıklık sisteminin miyeloid hücreleri tarafından ifade edilir8. TAM RTKs ‘nin birincil fonksiyonu, apoptotik hücrelerin ve enkaz fagositik çıkarılması kolaylaştırarak, tethering reseptörleri olarak hizmet etmektir. Grubumuz yıllardır otoimmünite ortamında TAM aracılı apoptotik hücre boşluğu okudu. K vitamini bağımlı protein büyüme tutuklama spesifik protein 6 (Gas6) ve protein S (artıları) bağlar ve tam reseptörleri aktive9,10. Gas6 kalp, böbrek ve akciğerde üretilmektedir. Artılar ağırlıklı olarak karaciğerde üretilmektedir11. TAM apoptotik hücrelerin Gas6/ProS N-terminali apoptotik bir hücre üzerinde PtdSer bağlanır ve Gas6/ProS C-terminali fagositlerin yüzeyine demirlemiş TAM reseptörlerine bağlanır böyle bir şekilde tanır. Diğer reseptörlerle birlikte, apoptotik hücrelerin Yutulmaları12oluşur. Mer hem ligin artıları ve Gas6 bağlayabilirsiniz olsa da, biz Gas6 tek ligand olarak görünür olduğunu bulundu, bu anti-Mer antikor tarafından engellenmiş olabilir apoptotik hücrelerin Mer-aracılı makrophaj fagositoz13. Macrofajlar profesyonel phagocytes vardır. Apoptotik hücrelerin makrofajlar tarafından hızlı bir şekilde temizlenmesi, inflamasyonun inhibisyonu ve hücre içi antijenlere karşı otoimmün tepkiler için önemlidir. Mer reseptörü Tirozin kinaz, makrophaj Yutulmaları ve apoptotik hücrelerin etkili boşluğu için önemlidir14. Fare dalağında, Mer ağırlıklı olarak marjinal bölge ve somut vücut makrofajlar13ifade eder.
Burada sunulan protokol, hücre apoptozu ikna etmek ve süreci ve efferocytosis etkinliğini ölçmek için yollar göstermek için temel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokoller, farklı kökenlerin apoptotik hücrelerin yutulmasında diğer hücre türleri tarafından effersitoz çalışması için kolayca adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptozis birçok sinyal Cascades içeren ve protein ifadesi, salgılanması ve ulaşım indükler bir son derece uyumlu hücre ölüm sürecidir. Apoptozis genellikle hücresel morfoloji değişiklikleri ile ilişkilidir17. Apoptotik hücreler, site ‘ye göç etmek için fagositler çeken sitokinleri ve kemokinlere aktif olarak serbest bırakır ve sıkı kontrol18‘ in altında son derece karmaşık bir yol olan alay sürecini başlatır. Öte yandan, necrotik hücre ölü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Shao laboratuvarında yapılan araştırmalar, tıp fakültesinden araştırma yenilikçi Ödülü ve Iç tıp bölümü ‘nden küçük fakülte pilot Ödülü, Cincinnati Üniversitesi ve NIDDK/NıH ‘dan Grant DK K01_095067 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
