Cuantificación de tres lesiones de ADN por espectrometría de masas y evaluación de sus niveles en los tejidos de los ratones expuestos a la materia particulada fina ambiental

Summary

Describimos aquí métodos para la cuantificación sensible y precisa de las lesiones 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n⁶-etheno-2′-deoxyadenosine (1,n⁶-dado) y 1,n²– etheno-2′-desoxyguanosine (1,N₂-DGUO) en el ADN. Los métodos se aplicaron a la evaluación de los efectos de las partículas finas ambientales (PM_2,5) en los tejidos (pulmón, hígado y riñón) de ratones expuestos A/J.

Abstract

Los aductos de ADN y las bases de ADN oxidado son ejemplos de lesiones de ADN que son biomarcadores útiles para la evaluación de la toxicidad de sustancias que son electrofilicas, generan electrófilos reactivos a la biotransformación o inducen estrés oxidativo. Entre las nucleobasas oxidadas, la más estudiada es la 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7,8-dihydro-2′-desoxyguanosine (8-oxodGuo), un biomarcador de daño base inducido oxidativamente en el ADN. Los aldehídos y los epoxialdehídos resultantes del proceso de peroxidación lipídica son moléculas electrofílicas capaces de formar aductos de ADN exocíclico mutagénico, tales como los aductos de etheno 1,n²-etheno-2′-deoxyguanosine (1,n²– εdGuo) y 1,n⁶-etheno-2′-deoxyadenosine (1,n⁶-εdado), que se han sugerido como biomarcadores potenciales en la fisiopatología de la inflamación. Los métodos selectivos y sensibles para su cuantificación en el ADN son necesarios para el desarrollo de estrategias preventivas que ralentizan las tasas de mutación celular y el desarrollo crónico de la enfermedad (p. ej., cáncer, enfermedades neurodegenerativas). Entre los métodos sensibles disponibles para su detección (cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a detectores de espectrometría de masas en tándem o electroquímico, ensayo de cometas, inmunoensayos, ³²P-etiquetado posterior), los más selectivos son los basados en cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas tándem (HPLC-ESI-MS/MS). La selectividad es una ventaja esencial al analizar muestras biológicas complejas y HPLC-ESI-MS/MS evolucionada como el estándar de oro para la cuantificación de nucleósidos modificados en matrices biológicas, como el ADN, la orina, el plasma y la saliva. El uso de estándares internos etiquetados isotópicamente añade la ventaja de las correcciones para las pérdidas de moléculas durante la hidrólisis del ADN y los pasos de enriquecimiento del analito, así como para las diferencias de la ionización del analito entre las muestras. También ayuda en la identificación del pico cromatográfico correcto cuando hay más de un pico presente.

Presentamos aquí métodos validados, precisos y precisos de HPLC-ESI-MS/MS que se aplicaron con éxito para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,N⁶-DAdo y 1,n²-dguo en pulmón, hígado y ADN renal de ratones A/J para la evaluación de los efectos de la exposición ambiental PM_2,5 .

Introduction

Algunas especies reactivas de oxígeno (ROS) son capaces de oxidar enlaces dobles de carbono de bases de ADN y algunos carbonos en la fracción desoxirribosa, generando bases oxidadas y roturas de hebras de ADN¹. Como una molécula cargada negativamente rica en átomos de nitrógeno y oxígeno, el ADN es también un objetivo para los grupos electrófilos que reaccionan covalentemente con los sitios nucleófilos (nitrógeno y oxígeno), dando productos que se denominan aductos de ADN². Por lo tanto, los aductos de ADN y las bases de ADN oxidado son ejemplos de lesiones de ADN que son biomarcadores útiles para la evaluación de la toxicidad de sustancias que son electrofilicas, generan electrófilos reactivos sobre la biotransformación, o inducen el estrés oxidativo^{1, 2}. Aunque las bases de ADN modificadas se pueden eliminar del ADN por la reparación de la escisión de base o nucleótido (BER o NER), la inducción de un desequilibrio entre la generación y la eliminación de las lesiones de ADN en favor de la primera conduce a un aumento neto de sus niveles en el ADN horas extras^{3 . Los resultados son el aumento de las tasas de mutación del ADN, la reducción de la expresión génica y la disminución de la actividad proteica2,4,5,6,7, efectos estrechamente relacionados con el desarrollo de enfermedades. Las mutaciones de ADN pueden afectar diversas funciones celulares, como la señalización celular, el ciclo celular, la integridad del genoma, la estabilidad del telómero, el epigenoma, la estructura de la cromatina, el empalme de ARN, la homeostasis proteica, el metabolismo, la apoptosis y la diferenciación celular8 ,9. Las estrategias para ralentizar las tasas de mutación celular y el desarrollo de enfermedades crónicas (p. ej., cáncer, enfermedades neurodegenerativas) pasan por el conocimiento de las fuentes de mutación, entre ellas, las lesiones de ADN y sus causas.}

Los ROS generados endógenamente en exceso, debido a la exposición a los contaminantes, la inflamación persistente, la fisiopatología de la enfermedad (p. ej., diabetes), etc., son causas importantes del daño de la biomolécula, incluyendo el ADN y el daño lipídico¹. Por ejemplo, el radical hidroxilo altamente reactivo (OH) formado a partir de la reducción de H₂O₂ por iones metálicos de transición (fe^{2 +}, cu⁺) oxida las bases de ADN, la fracción de azúcar de ADN y los ácidos grasos poliinsaturados en la difusión controlada tarifas¹⁰. Entre las 80 nucleobasas oxidadas ya caracterizadas³, el más estudiado es 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) o 8-oxo-7,8-dihydro-2′-desoxyguanosine (8-oxodGuo, figura 1), una lesión que es capaz de inducir transversiones gt en células de mamíferos^10,11. Se forma por la oxidación electrónica mono de guanina, o por el ataque de oxígeno de la guanina a radical hidroxilo o singlete en el ADN¹. Los ácidos grasos poliinsaturados son otros objetivos importantes de los oxidantes altamente reactivos, tales como ^•Oh, que inician el proceso de peroxidación lipídica^1,12. Da lugar a hidroperóxidos de ácidos grasos que pueden descomponerse a aldehídos electrófilos y epoxialdehídos, tales como malondialdehído, 4-hidroxi-2-Nonenal, 2,4-Decadienal, 4, 5-epoxi-(2E)-decenal, hexenal, Acrolein, Crotonaldehído, que son puede formar aductos de ADN exocíclico mutagénico, tales como malondialdehído-, propano-, o los aductos de etheno^1,12,13. Los aductos de etheno 1,n²-etheno-2′-deoxyguanosine (1,n²-εdguo , figura 1) y 1,n⁶-etheno-2′-deoxyadenosine (1,n⁶-εdado, figura 1 ) se han sugerido como biomarcadores potenciales en la fisiopatología de la inflamación^14,15.

Figura 1. Estructuras químicas de las lesiones de ADN cuantificadas en el presente estudio. dR = 2 ́-desoxiribosa. Esta cifra ha sido modificada de Oliveira et al.³⁴. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los estudios realizados a comienzos de la década de 1980 permitieron la detección sensible de 8-oxodGuo por cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a la detección electroquímica (HPLC-ECD). La cuantificación de 8-oxodguo por HPLC-ECD en varios sistemas biológicos sometidos a condiciones oxidantes condujo al reconocimiento de 8-oxodguo como un biomarcador de daño base inducido oxidativamente en el ADN^1,16. Aunque son robustos y permiten la cuantificación de 8-oxodGuo en la gama baja de fmol¹⁷, las mediciones de HPLC-ECD se basan en la precisión del tiempo de retención del analito para la identificación del analito y en la resolución de la cromatografía para evitar interferencias de otros componentes de la muestra. Como la detección electroquímica requiere el uso de sal (por ejemplo, fosfato de potasio, acetato de sodio) en la fase móvil, el mantenimiento de condiciones analíticas adecuadas necesita tiempo de limpieza de columna y equipo de rutina.

Alternativamente, el uso de la enzima de reparación de ADN bacteriológico formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG) y, después, 8-oxoguanina glucosilasa 1 (hOGG1), para la detección y eliminación de 8-oxogua de ADN, surgió como una manera de la inducción de ADN alcalino lábil Sitios. Los sitios del lábil alcalino se convierten en roturas de la hebra de ADN y permiten la cuantificación indirecta muy alta sensible de 8-oxogua por electroforesis de gel de una sola célula alcalina (“ensayo de cometa”). La alta sensibilidad y la realización de los análisis sin necesidad de extracción de ADN celular son las principales ventajas de este tipo de ensayo. Da los niveles de estado estacionario más bajos de 8-oxoGua en el ADN, típicamente 7-10 veces más bajo que los niveles obtenidos por métodos bioanalíticos basados en HPLC. Sin embargo, es una medida indirecta de 8-oxogua y algunos inconvenientes son la falta de especificidad o la eficiencia desconocida de las enzimas de reparación utilizadas^1,16,18.

Los inmunoensayos son otro conjunto de métodos utilizados para la detección de aductos de ADN 8-oxoGua¹ y exocíclico, tales como 1,n⁶-dado y 1,n²-dguo¹². A pesar de la sensibilidad, una deficiencia del uso de anticuerpos para la detección de lesiones de ADN es la falta de especificidad debido a la reactividad cruzada a otros componentes de muestras biológicas, incluyendo las bases de ADN normales^1,12. Los aductos de ADN exocíclico, incluyendo 1,n⁶-DAdo y 1,n²-dguo, también pueden ser detectados y cuantificados por los ensayos altamente sensibles de ³²P-postetiquetado¹². La alta sensibilidad de ³²P-el etiquetado posterior permite el uso de cantidades muy pequeñas de ADN (por ejemplo, 10 μg) para la detección de aproximadamente 1 aducto por 10¹⁰ bases normales¹⁹. Sin embargo, el uso de radioquímicos, la falta de especificidad química y la baja precisión son algunas desventajas^19,20.

Una limitación compartida de los métodos citados anteriormente es la baja selectividad o especificidad para la detección de las moléculas deseadas. En este escenario, la HPLC acoplada a la espectrometría de masas tándem de ionización electrospray (HPLC-ESI-MS/MS y HPLC-MS³) evolucionó como el estándar de oro para la cuantificación de nucleósidos modificados en matrices biológicas, como el ADN, la orina, el plasma y la saliva ^{1 , 19 , 20}. las ventajas de los métodos HPLC-ESI-MS/MS son la sensibilidad (típicamente en la gama baja de fmol) y la alta especificidad proporcionada por i) la separación cromatográfica, II) el patrón característico y conocido de fragmentación molecular dentro de la masa cámara de colisión espectrómetro, y III) la medición precisa de la relación masa a carga seleccionada (m/z) en el modo de monitorización de reacción múltiple^1,19. El uso de estándares internos etiquetados isotópicamente añade la ventaja de las correcciones para las pérdidas de moléculas durante la hidrólisis del ADN y los pasos de enriquecimiento del analito, así como para las diferencias de la ionización del analito entre las muestras. También ayuda en la identificación del pico cromatográfico correcto cuando hay más de un pico presente^1,12,19,20.

Se han utilizado varios métodos basados en HPLC-ESI-MS/MS para la cuantificación de 8-oxodguo, 1, N⁶-dado y 1,n²-dguo en el ADN extraído de diferentes muestras biológicas^{12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28},²⁹ . Las partículas finas (PM_2,5) transportan productos químicos orgánicos e inorgánicos, tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), Nitro-PAHS, aldehídos, cetonas, ácidos Carboxilicos, quinolinas, metales y iones solubles en agua, que pueden inducir inflamación y estrés oxidativo, condiciones que favorecen la ocurrencia de daño biomolecular y enfermedad^30,31,32,33. Aquí presentamos métodos validados de HPLC-ESI-MS/MS que se aplicaron con éxito para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,N⁶-DAdo y 1,N²-dguo en pulmón, hígado y ADN renal de ratones A/J para la evaluación de la efectos de la exposición ambiental PM_2,5 ³⁴.

Protocol

Ratones a/J masculinos de cuatro semanas de edad, libres de patógenos específicos, se obtuvieron del centro de cría de animales de laboratorio de la Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Río de Janeiro, Brasil, y fueron tratados en consecuencia al Comité ético de la Facultad de medicina, Universidad de São Paulo (Protocolo no 1310/09). 1. recolección de los tejidos de ratones Anestesiar el animal con xilazina y ketamina. Para un ratón con 30 g de peso corporal, inyec…

Representative Results

Las concentraciones medias de ADN (± SD) obtenidas a partir de ratones hígado (~ 1 g de tejido), pulmón (~ 0,2 g de tejido) y riñón (~ 0,4 g de tejido) fueron, respectivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 y 3.223 ± 723 μg/mL en el volumen final de 200 μL. En la figura 3se muestra un cromatograma representativo obtenido por HPLC-DAD del ADN purificado. La presencia de los cuatro 2 ‘-desoxinucleósidos, libre del ARN ribonucleósidos, que eluye inmed…

Discussion

Un problema importante que se encuentra en los análisis de 8-oxodguo por métodos de HPLC es la posible inducción de su formación durante los procedimientos de trabajo de extracción de ADN, hidrólisis de ADN, y la concentración de ADN hidrolizados^22,38. Con el fin de minimizar el problema de la formación artística de 8-oxodGuo, se recomienda la adición de deferoxamina a todas las soluciones de extracción de ADN, almacenamiento e hidrólisis, el uso del …

Materials

[15N5]-2’-deoxyadenosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3899-CA-10
acetonitrile	Carlo Erba Reagents	412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa	Sigma	P5521
ammonium acetate	Merck	101116
calf thymus DNA	Sigma	D1501
cell lysis solution	QIAGEN	158908
chloroform	Carlo Erba Reagents	412653
deferoxamine	Sigma	D9533
deoxyribonuclease I (DNase I)	Bio Basic Inc	DD0649
ethanol	Carlo Erba Reagents	414542
formic acid	Sigma-Aldrich	F0507
HPLC-ESI-MS/MS system	HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments	HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system	Shimadzu	Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18)	Phenomenex	00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18)	Phenomenex	00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18)	Phenomenex	00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)	Phenomenex	AJO-4287
isoamyl alcohol	Sigma-Aldrich	M32658
isopropyl alcohol (isopropanol)	Carlo Erba Reagents	A412790010
ketamine	Ceva	Commercial name: Dopalen
magnesium chloride	Carlo Erba Reagents	349377
magnesium chloride	Sigma	M2393
methanol	Carlo Erba Reagents	L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox	Sigma	P4506
protein precipitation solution	QIAGEN	158912
proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
ribonuclease A	Sigma	R5000
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
SPE-C18 (Strata-X)	Phenomenex	8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carlo Erba Reagents	489983
xylazine	Syntec do Brasil	Commercial name: Xilazin