Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal adulta do falange do rato para investigar a formação mamífero do blastema e a ossificação intramembranosos, analisadas pelo immunohistochemistry fluorescente e pelo tomography microcomputado in-vivo seqüencial.

Abstract

Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal distal do falange (P3) do rato adulto, um modelo mamífero processualmente simples e reprodutível da regeneração epimórfica, que envolve a formação do blastema e a ossificação intramembranosos analisadas por Immunohistochemistry da fluorescência e tomography microcomputado in-vivo seqüencial (μCT). A regeneração dos mamíferos é restrita a amputações que transecting a região distal do terminal falange (P3); os dígitos amputados em uns níveis mais proximal não conseguem regenerar e submeter-se à cura fibrótica e à formação da cicatriz. A resposta de regeneração é mediada pela formação de um blastema proliferativo, seguido pela regeneração óssea via ossificação intramembranosa para restaurar o comprimento esquelético amputado. A amputação P3 é um modelo pré-clínico para investigar a regeneração epimórfica em mamíferos, e é uma ferramenta poderosa para o projeto de estratégias terapêuticas substituir a cura fibrótica com uma resposta regenerativa bem sucedida. Nosso protocolo usa a imunohistoquímica de fluorescência para 1) identificar populações de células de blastema precoces, 2) revascularização do estudo no contexto da regeneração e 3) investigar a ossificação intramembranosa sem a necessidade de osso complexo dispositivos de estabilização. Também demonstramos o uso de μCT sequencial in vivo para criar imagens de alta resolução para examinar as alterações morfológicas após a amputação, bem como quantificar mudanças de volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. Nós acreditamos que este protocolo oferece a utilidade tremenda para investigar epimórfica e respostas regenerativa do tecido nos mamíferos.

Introduction

Os mamíferos, incluindo humanos e camundongos, têm a capacidade de regenerar as pontas de seus dígitos após a amputação distal da falange terminal (P3^{) 1,2,3}. Em camundongos, a resposta de regeneração é dependente do nível de amputação; As amputações cada vez mais proximal do dígito exibem uma resposta regenerativa progressivamente atenuada até a falha regenerativa completa em amputações que transecting e proximal à matriz de prego P3^{4,5,6 , 7} anos de ^{, 8}. a regeneração P3 é mediada pela formação de um blastema, definido como uma população de células proliferantes que passam por morfogênese para regenerar as estruturas amputadas⁹. A formação de um blastema para regenerar as estruturas perdidas pela amputação, um processo denominado regeneração epimórfica, distingue a resposta de regeneração P3 de nível multitecidual do reparo tecidual tradicional após a lesão^{6, 10}. a regeneração P3 é um modelo reprodutível e proceduralmente simples para investigar processos regenerativos complexos, incluindo cicatrização de feridas^11,12, histólise^11,12, revascularização¹³, regeneração periférica¹⁴do nervo, e conversão de blastemal ao osso através da ossificação intramembranosos¹⁵.

Estudos prévios com imunohistoquímica demonstraram que o blastema é heterogêneo, avascular, hipóxico e altamente proliferativo^11,13,15,16. Após a amputação distal do P3, o blastema precoce é inicialmente associado ao periósteo P3 e ao endoesteto e caracteriza-se por proliferação robusta e osteogênese nascente adjacente à superfície óssea¹⁵. Subseqüente à degradação do osso e ao fechamento da ferida, o blastema heterogêneo é dado forma pela fusão de pilhas periosteal e endoroubo-associadas, seguidas pela diferenciação de componentes blastemal que incluem o osso através da ossificação ^{intramembranosos quinze anos}.

O reparo ósseo em resposta à lesão ocorre tipicamente pela ossificação endocondral, ou seja, por meio de um calo cartilaginoso inicial que forma um modelo de formação óssea subseqüente^17,18. A ossificação intramembranosos do osso longo, isto é, formação do osso sem um intermediário cartilaginoso, é induzida geralmente usando dispositivos complexos da distracção ou a fixação cirúrgica^19,20. A resposta de regeneração de dígitos é um modelo pré-clínico que oferece vantagens sobre os modelos de ossificação intramembranosa convencional: 1) não requer lesão pós-fixação externa ou interna para estimular a ossificação intramembranosa, 2) é realizada com 4 dígitos de cada animal, maximizando as amostras e minimizando o uso de animais, e 3) a análise sequencial in vivo do tomography microcomputado (μCT) pode ser executada com facilidade e velocidade.

No presente estudo, mostramos o plano de amputação P3 padronizado para obter uma resposta de regeneração reprodutível e robusta. Adicionalmente, Nós demonstramos um protocolo aperfeiçoado da imunohistoquímica da fluorescência usando seções da parafina para visualizar a formação do blastema, o revascularização no contexto da regeneração, e a conversão blastemal ao osso através de intramembranosos Ossificação. Também demonstramos o uso de μCT in vivo sequencial para identificar alterações na morfologia óssea, volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. O objetivo deste protocolo é investigar a formação de blastema de mamíferos após a amputação e demonstrar 2 técnicas, imunohistoquímica de fluorescência e μCT in vivo sequencial, para o estudo da regeneração óssea intramembranosa.

Protocol

Todo o uso e técnicas de animais estavam em conformidade com os procedimentos operacionais padrão do Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Texas A & M. 1. amputação do distal P3 do membro adulto do mouse traseiro Anestesie um mouse CD-1 de 8 a 12 semanas (tabela de materiais) usando gás isoflurano em oxigênio; inicialmente anestesiados a 3% em uma câmara, seguido de 2% de isoflurano fornecido por uma nosecona durante o período …

Representative Results

O rato adulto que regenera os dígitos P3 em 6/7 DPA (Figura 2a-D), 9 DPA (Figura 2e-H), e 10 DPA (Figura 2i-L) foi immunomanchado com os anticorpos a Runx2, a OSX, e a PCNA para visualizar o osso intramembranosos regeneração, e immunomanchado com os anticorpos a CXCR4 e a fvw para visualizar a formação do blastema. Representações de μCT representativas de dígitos verificado…

Discussion

Este protocolo descreve um procedimento padronizado da amputação P3 longe do ponto de origem do rato adulto, mancha immunohistochemical fluorescente para visualizar e investigar a formação do blastema e a ossificação intramembranosos, e a exploração sequencial in vivo do μct a identificar alterações morfológicas ósseas, volume e comprimento pós-amputação. A amputação P3 é um modelo único, proceduralmente simples e reprodutível para analisar um ambiente pró-regenerativo da ferida que desencadeia a fo…

Materials

Protein Block Serum Free	DAKO	X0909	Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody	Abcam	ab29	1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody	R&D Systems	MAB21651	1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody	DAKO	A0082	1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody	Abcam	ab22552	1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	Ready to use
Surgipath Decalicifier 1	Leica Biosystems	3800400	Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative	Anatech LTD	174	Ready to use
CD-1 Female Mouse	Envigo	ICR(CD-1)	8-12-weeks-old
vivaCT 40	SCANCO Medical