المناعية انحطاط Myofiber في العضلات الخزعات
Summary
وصف هنا هو بروتوكول للمناعة المباشرة من ألياف العضلية الميتة في العضلات. الخلايا الميتة هي نفاذيه للبروتينات المصل ، بما في ذلك الغلوبولين المناعي G (مفتش). الكشف عن امتصاص مفتش من قبل myofibers يسمح لتحديد والتقدير الكمي من ألياف العضلية التي تخضع لنخر بغض المثل عن حاله العضلات.
Abstract
نخر ألياف العضلات (فرط التعرق) يلعب دورا مركزيا في التسبب في العديد من الحالات العضلية, بما في ذلك حثل العضلات. من المتوقع ان تخفف الخيارات العلاجية التي تعالج أسباب الضمور العضلي من انحطاط العضلات. لذلك ، هناك حاجه إلى طريقه لفحص وقياس مدي موت الخلايا في الخزعات العضلية. الطرق التقليدية لمراقبه تنكس ألياف العضلية في الموقع اما ضعيفه الكمية أو تعتمد علي حقن الاصباغ الحيوية. في هذه المقالة ، يوصف بروتوكول المناعية ان البقع ألياف العضلية الميتة عن طريق استهداف الغلوبولين المناعي G (مفتش) امتصاص من قبل ألياف العضلية. ويستند أسلوب امتصاص مفتش علي ميزات الخلية تميز زوال نخريه ، بما في ذلك 1) فقدان سلامه غشاء البلازما مع الإفراج عن الاضرار المرتبطة الأنماط الجزيئية و 2) امتصاص البروتينات البلازما. في الأجزاء المتقاطعة murine ، والمناعية المشتركة من ألياف العضلية ، والبروتينات مصفوفة خارج الخلية ، والماوس مفتش يسمح بالتحديد النظيف والمباشر للألياف العضلية مع مصير نخريه. هذه الطريقة البسيطة مناسبه للتحليل الكمي وقابله للتطبيق علي جميع الأنواع ، بما في ذلك العينات البشرية ، ولا تتطلب حقن صبغه حيوية. ويمكن أيضا تلطيخ من ألياف العضلية نخريه من امتصاص مفتش ان يقترن مع غيرها من المناعية المشتركة.
Introduction
العضلات الهيكلية الشريطية تتكون أساسا من ألياف العضلات (ألياف العضلية) ، والتي هي المسؤولة عن وظيفة مقلص الطوعية المميزة. هذه الخلايا هي نوى ، وهياكل ما بعد الانقسام التي تدعم الإجهاد الميكانيكية التي تحدث اثناء الانكماش. الاستقرار الهيكلي لغشاء ميوليف (ساركولايما) ومصفوفة خارج الخلية هي حاسمه للتوازن الانسجه. خلايا الأقمار الصناعية تشكل العضلات الرئيسية السكان السلف في العضلات الهيكل العظمي ناضجه وموجودة في حاله هادئه في عضلات صحية. بعد وفاه ألياف العضلية ، يتم دعم تجديد العضلات بواسطة خلايا الأقمار الصناعية التي تتبع البرنامج العضلي الذي ينطوي علي تنشيط الخلايا الساتليه ، والانتشار ، والتمايز ، والانصهار لتشكل في نهاية المطاف نوى ليف جديده.
يمكن ان يحدث زوال ألياف العضلية في حالات العضلات المتعددة ، بما في ذلك الصدمات الميكانيكية ، وإصابات نقص التروية ، أو حثل العضلي ، ويرتبط بالتشكل الميت للخلايا النافقة1،2. ويتميز الموت نخريه من نفاذيه السريع لغشاء البلازما والإفراج عن محتوي الخلية في المقصورة خارج الخلية3. ويمكن ان ينتج اما عن عمليه غير منظمه لا تنطوي علي اشاره الخلية السليمة (اي النخر العرضي) ، أو مسار منظم داخل الخلايا (اي النخر المنظم). في ألياف العضلية ، وينظم كل من4 وغير المنظم5 عمليات يمكن ان يؤدي إلى نخر. ومن النتائج النموذجية للتهاب المفاصل هو الإفراج عن أنماط الجزيئات المرتبطة بالضرر ، وتفعيل استجابه التهابيه قويه6. لوحظ وجود الضامة في حوالي 48 h و 72 h بعد الاصابه7. وبالاضافه إلى دورها في أزاله الحطام نخريه ، فهي أيضا مهمة في تجديد العضلات8،9.
حثل العضلي (MDs) هي مجموعه غير متجانسة من الامراض التي غالبا ما تنجم عن عيب في بنيه ساركولايما. ضمور العضلات duchenne (DMD) هو مرض الاحداث المرتبطة ب X التي تؤثر علي ما يقرب من 1 من كل الولادات الذكور 3,500 في جميع انحاء العالم10، وسببه عدم وجود dystrophin التعبير في sarcolemma. الانحطاط المزمن للانسجه العضلية في DMD الأولاد يؤدي إلى ضعف العضلات المدقع والوفاات المبكرة. التهاب الناتج عن الموت نخريه يعزز السمية الخلوية ، ويعزز التليف العضلي وفقدان وظيفة العضلات11،12. العلاجات الحالية في التجارب السريرية التي تستهدف جذور الاضطرابات التنكسية العضلية ، مثل العلاج الجيني ، من المتوقع ان تخفف من التهاب المفاصل. ولذلك هناك حاجه إلى تقنيات بسيطه لقياس انحطاط العضلات بدقه.
يتم استخدام عده طرق بشكل روتيني لمراقبه فقدان ألياف العضلية في الجسم المجري. قياس النشاط الانزيمي من الكرياتين كيناز (CK) في الدم يسمح كميات موثوقه من النخر المستمر في انسجه العضلات والقلب. في الموقع ، وتلطيخ هيماتوكسيلين و ايوسين (H & E) هو الأسلوب الأكثر شعبيه المستخدمة حاليا في التشخيص لتقييم انحطاط التجديد أعاده النمذجة. بيد ان الأساس الجزيئي لوسم الخلايا الميتة & E لا يزال غير واضح. وعلاوة علي ذلك ، التعديلات اللون مما يوحي الموت ليف في تلطيخ H & E هي خفيه نسبيا ولا تسهل التحديد الكمي موثوق بها واستنساخها. طرق الكشف عن تجزئه الحمض النووي ، مثل المحطة الطرفية ديكسينوكليوديتيل الناقل dutp نك نهاية الوسم (tunel) ، التسمية ناقص الموت نخريه3. كما انها غير مهياه بشكل سيء لرصد وفاه الخلايا الخلوية مثل ألياف العضلية. حقن الاصباغ الحيوية ، مثل صبغه ايفان الزرقاء (EBD) ، يمثل بديلا مفيدا لتقييم ألياف العضلية التي فقدت سلامه ساركولايما ، ولكن ليس بالضرورة مريحه في بعض البروتوكولات التجريبية. فعلي سبيل المثال ، يمكن ان يؤثر وجود EBD في عينات الدم علي نتائج قياسات الكورونا التشيكية ، وهو فحص لوني. وعلاوة علي ذلك ، امتصاص داخل الخلايا من EBD يجعل التعاون المناعي تحديا. ولذلك ، فان الطريقة البديلة التي تسمح بالوسم المباشر للألياف العضلية التي تمر بالنخر هي ذات فائده.
تعتمد اليه عمل الاصباغ الحيوية علي فقدان سلامه غشاء البلازما في ألياف العضلية الميتة والامتصاص السلبي لصبغه الحقن. المثل ، امتصاص ميونوتيك بروتينات الدم مثل الزلال ، والتي EBD لديه تقارب قوي13،14، الغلوبولين المناعي G (مفتش) ، و15الغلوبولين. التالي فان وجود غير طبيعي للبروتينات الدم داخل ألياف العضلية يمثل علامات مريحه للتهاب المفاصل في الموقع. تلطيخ هذه البروتينات يمكن ان يكون بديلا لاستخدام الاصباغ الحيوية.
باستخدام امتصاص مفتش كعلامة علي فرط التعرق في الموقع, ويستخدم هذا البروتوكول لتقييم انحطاط العضلات في الامامي الظنبوبي (TA) من الفئران mdx dystrophin ناقص. ويقدم هذا الأسلوب مزايا كبيره علي التقنيات البديلة: 1) انها قابله للاستنساخ وبسيطه في تنفيذه ؛ 2) انه لا يتطلب اي علاج الحيوانية قبل جمع العضلات ، مثل حقن الاصباغ الحيوية المتداولة ، و 3) كما اي المناعية التقليدية ، فانه متوافق مع وضع العلامات المشتركة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نخر myofiber هو نتيجة شائعه لممارسه الصدمة في العضلات العادية. ويعوض جيدا من قدره التجدد قويه من المولدين العضلات المحلية. ومع ذلك, في العديد من الحالات العضلات مثل في MDs, القدرة علي التجدد من الخلايا الأقمار الصناعية للخطر من قبل التهاب المفاصل المزمن والتليف المفرط. وتظهر النتائج الاخيره ان ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم الرابطة الفرنسية لمكافحه الامراض العضلية مع برنامج التسلية الانتقالية. ويشكر المؤلفان الدكتور بيرلا رييس فرنانديز والدكتور ماثيو بوروك علي قراءتهما المتانيه للمخطوطة.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
