Immunolabelling myofiber degeneration i muskelbiopsier
Summary
Beskrevet her er en protokol til direkte immun mærkning af nekrotiske myofibers i muskel kryosektioner. Nekrotiske celler er gennemtrængelig for serumproteiner, herunder immunglobulin G (IgG). Afslørende optagelsen af IgG ved myofibers tillader identifikation og kvantificering af myofibers, der gennemgår nekrose uanset muskel tilstand.
Abstract
Nekrose af muskelfibre (myonecrose) spiller en central rolle i patogenesen af flere muskel tilstande, herunder muskuløs dystrophies. Terapeutiske muligheder tackle årsagerne til muskuløs dystrofi patogenesen forventes at lindre muskel degeneration. Derfor er en metode til at assay og kvantificere omfanget af celledød i muskelbiopsier er nødvendig. Konventionelle metoder til at observere myofiber degeneration in situ er enten dårligt kvantitative eller stole på injektion af vitale farvestoffer. I denne artikel, en immunofluorescenstest protokol er beskrevet, at pletter nekrotiske myofibers ved at målrette immunglobulin G (IgG) optagelse af myofibers. IgG-optagelsesmetoden er baseret på celle funktioner, der karakteriserer den nekrotiske død, herunder 1) tabet af plasma membranens integritet med frigivelsen af skade relaterede molekylære mønstre og 2) optagelsen af plasmatiske proteiner. I murine tværsnit, den Co-immunolabelling af myofibers, ekstracellulære matrix proteiner, og mus IgG tillader ren og ligetil identifikation af myofibers med nekrotisk skæbne. Denne enkle metode er egnet til kvantitativ analyse og gælder for alle arter, herunder humane prøver, og kræver ikke injektion af vitale farvestof. Farvning af nekrotiske myofibre ved IgG-optagelse kan også kombineres med andre Co-immunolabelling.
Introduction
Tværstrieret skeletmuskulatur består hovedsageligt af muskelfibre (myofibers), som er ansvarlige for den karakteristiske frivillige kontraktile funktion. Disse celler er flerkernede, post-mitotiske strukturer, der understøtter mekanisk stress opstår under sammentrækning. Strukturel stabilitet af myofiber membranen (sarcolemma) og dens ekstracellulære matrix er afgørende for vævs homøostase. Satellit celler udgør den vigtigste muskel progenitorpopulation i modne skeletmuskulatur og findes i en lysende tilstand i raske muskler. Efter myofiber død, er muskel regenerering understøttet af satellit celler efter et myogen program, der involverer satellit celle aktivering, spredning, differentiering, og fusion til sidst danne nye flerkernede myofibers.
Myofiber død kan forekomme i flere muskel forhold, herunder mekaniske traumer, iskæmi-reperfusion skader, eller muskuløs dystrophies, og det er forbundet med den nekrotiske morfologi af døde celler1,2. Nekrotisk død er karakteriseret ved den hurtige permeabilitet af plasma membranen og frigivelse af celleindhold i det ekstracellulære rum3. Det kan skyldes enten en ureguleret proces, der ikke involverer nogen ordentlig celle signalering (dvs. utilsigtet nekrose), eller en orkestrated intracellulær pathway (dvs., reguleret nekrose). I myofibers, både regulerede4 og ureguleret5 processer kan føre til nekrose. En typisk konsekvens af myonecrosis er frigivelsen af skader-associerede molekyle mønstre, aktivering af en kraftig inflammatorisk respons6. Tilstedeværelsen af makrofager er observeret på omkring 48 h og 72 h efter skade7. Udover deres rolle i clearance af nekrotiske vragrester, de er også vigtige i muskel regenerering8,9.
Muskel dystrophier (MDs) er en heterogen gruppe af patologier, som ofte skyldes en defekt i sarcolemma struktur. Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en juvenil X-linked sygdom, der påvirker ca 1 ud af hver 3.500 mandlige fødsler på verdensplan10, og det er forårsaget af fraværet af dystrofin udtryk på sarcolemma. Kronisk degeneration af muskelvæv i DMD drenge fører til ekstrem muskelsvaghed og tidlig dødelighed. Betændelse som følge af nekrotisk død øger cytotoksicitet, og fremmer muskel fibrose og tab af muskelfunktion11,12. Behandlinger i øjeblikket i kliniske forsøg rettet mod rødderne af muskel degenerative lidelser, såsom genterapi, forventes at lindre myonekrose. Der er derfor behov for enkle teknikker til nøjagtig kvantificering af muskel degeneration.
Flere metoder bruges rutinemæssigt til at overvåge myofiber tab in vivo. Målingen af den enzymatiske aktivitet af kreatinkinase (CK) i blodet giver mulighed for pålidelig kvantificering af igangværende nekrose i muskler og hjerte væv. In situ, hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning er den mest populære metode, der i øjeblikket anvendes i diagnose for at vurdere degeneration-regenerering remodelling. Men det molekylære grundlag for H & E mærkning af døde celler er stadig uklar. Desuden farveændringer tyder myofiber død i H & E farvning er relativt subtile og ikke fremmer pålidelig og reproducerbar kvantificering. Metoder afslører DNA-fragmentering, såsom Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick ende mærkning (TUNEL), ufuldkomment etiket nekrotisk død3. De er også dårligt tilpasset til at overvåge død af syncytial celler såsom myofibers. Injektion af vitale farvestoffer, såsom Evan blå farvestof (EBD), repræsenterer et nyttigt alternativ til vurdering af myofibers, der har mistet integriteten af sarcolemma, men er ikke nødvendigvis praktisk i nogle eksperimentelle protokoller. For eksempel kan tilstedeværelsen af EBD i blodprøver påvirke resultaterne af CK målinger, en kolorimetrisk analyse. Desuden gør intracellulær optagelse af EBD medimmunolabelling udfordrende. Derfor er en alternativ metode til at tillade direkte mærkning af myofibers, der gennemgår nekrose, af interesse.
Virkningsmekanismen af vitale farvestoffer afhænger af tabet af plasma membranens integritet i nekrotiske myofibers og den passive optagelse af det injicerede farvestof. Tilsvarende, nekrotiske myofibers optagelse blodproteiner såsom albumin, for hvilke EBD har en stærk affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), og IgM15. Den unormale tilstedeværelse af blodproteiner inden for myofibers repræsenterer derfor bekvemme markører for myonekrose in situ. Farvning disse proteiner kan være et alternativ til brug af vitale farvestoffer.
Ved at bruge IgG-optagelse som markør for myonecrosis in situ anvendes denne protokol til at vurdere muskel degeneration i tibias forreste (Ta) af MDX dystrophin-mangelfulde mus. Denne metode giver betydelige fordele i forhold til alternative teknikker: 1) den er reproducerbar og enkel i sin udførelse; 2) det kræver ikke nogen dyre behandling forud for muskel indsamling, såsom injektion af cirkulerende vitale farvestoffer, og 3) som enhver konventionel immunolmærkning, det er foreneligt med co-mærkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myofiber nekrose er en almindelig konsekvens af traumatisk motion i normale muskler. Det er godt kompenseret af en kraftfuld regenerativ kapacitet af de lokale muskel progenitorer. Men i flere muskel tilstande som i MDS, er den regenerativ kapacitet af satellit celler kompromitteret af kronisk myonekrose og overdreven fibrose. Nylige fund viser, at muskelfibrene kan dø ved nekroptose, en reguleret form for nekrose. Mere specifikt kan hæmning af nekroptose blive en ny terapeutisk strategi for DMD behandling<sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Association Française contre les Myopathies med Translamuscle programmet. Forfatterne takker Dr. Perla Reyes-Fernandez og Dr. Matthew Borok for deres omhyggelige læsning af manuskriptet.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
