אימונוולבלינג מיוכי ניוון שרירים ביופסיות
Summary
שמתואר כאן הוא פרוטוקול עבור חיסונית ישירה של מיותטיות של מיוכי שרירים סעיפים. התאים הנקרוסטיים הם חדירות לחלבונים בסרום, לרבות חיסוני G (IgG). חשיפת ספיגת IgG על ידי מיותסיבים מאפשר זיהוי וקוונפיקציה של מיותסיבים שעוברים נמק ללא קשר למצב שריר.
Abstract
נמק של סיבי שריר (מצוי) ממלא תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מספר מצבים שרירים, כולל dystrophies שרירים. האפשרויות הטיפוליות המתייחסות לגורמים שרירי ניוון שרירים צפויים להקל על ניוון שרירים. לכן, שיטה לקיים ולכמת את היקף מוות התאים בביופסיה שרירים נדרשת. שיטות קונבנציונליות להתבונן ניוון מיוכי באתרו הם או כמותיים גרוע או להסתמך על הזרקת של צבעים חיוניים. במאמר זה, פרוטוקול immunofluorescence מתואר כי כתמי נמק מיותמים על ידי מיקוד חיסוני G (IgG) ספיגה של סיבים מיומים. שיטת ספיגה IgG מבוססת על תכונות תא המאפיינים את מותו נמק, כולל 1) אובדן של שלמות קרום הפלזמה עם שחרורו של דפוסי נזק מולקולרי הקשורים ו 2) ספיגת חלבונים פלטיים. ב צולבות מוריין סעיפים, שיתוף החיסונית של מיוסים של סיבים מיותאיים, מטריקס חלבונים, ועכבר IgG מאפשר זיהוי נקי וברור של סיבים מיוטיים עם גורל נקרוטי. שיטה פשוטה זו מתאימה לניתוח כמותי וישימה לכל המינים, כולל דגימות אנושיות, ואינה דורשת הזרקה של צבע חיוני. את הצביעת של הסיבים נמק על ידי ספיגת IgG ניתן גם לזווג עם שיתוף החיסונית אחרים.
Introduction
שריר השלד הסטרינטי מורכב בעיקר מסיבי שריר (מיוסיבים), האחראים על התפקוד הרצוני האופייני. תאים אלה הם מבנים שלאחר הmitotic, התומכים בלחץ מכני המתרחשים במהלך התכווצות. יציבות מבנית של קרום מיוסיבי (sarcolemma) ומטריצה החילוץ שלה חיוניים הומאוסטזיס רקמות. תאי לווין מהווים את האוכלוסייה הראשית של שריר השריר בשריר השלד הבוגר וקיים במצב שקט יותר בשרירים בריאים. בעקבות מוות מיוסיבי, התחדשות שרירים נתמכת על ידי תאי לווין בעקבות תוכנית מיוגניים המערבת תא לווין הפעלה, התפשטות, בידול, והיתוך כדי בסופו של דבר הטופס החדש ביותר מיוקלסין סיבים.
מיומות מוות יכול להתרחש בתנאים שרירים מרובים, כולל טראומה מכנית, איסכמיה-reperfusion פציעות, או dystrophies שרירי, והוא משויך הורפולוגיה נקרוטית של תאים מתים1,2. מוות נקרוטי מאופיין חדירות מהירה של קרום הפלזמה ושחרורו של תוכן התא בתא החילוץ3. זה יכול לנבוע מתהליך בלתי מוסדר מעורבים לא האיתות התא הנכון (כלומר, נמק בשוגג), או מסלול תאיים מאורגן (כלומר, נמק מוסדר). ב סיבים מיואלה, הן מוסדרים4 ו לא מוסדר5 תהליכים יכולים להוביל נמק. תוצאה אופיינית של הבוליזיס היא שחרור של דפוסי מולקולה הקשורים נזק, הפעלת תגובה דלקתית רבת עוצמה6. הנוכחות של מקרופאגים הוא נצפתה סביב 48 h ו 72 h לאחר הפציעה7. מלבד תפקידם בסיווג של פסולת נמק, הם חשובים גם התחדשות שרירים8,9.
Dystrophies שרירים (MDs) הם קבוצה הטרוגנית של פתווגיות אשר לעתים קרובות תוצאה של פגם במבנה sarcolemma. ניוון שרירים duchenne (DMD) הוא מחלה הקשורה לקטינים X המשפיעים על כ 1 מתוך כל 3,500 זכר לידות ברחבי העולם10, וזה נגרם על ידי היעדר הביטוי הדיסטרופין בsarcolemma. ניוון כרוני של רקמת השריר בילדי DMD מוביל לחולשת שרירים קיצונית ותמותה מוקדמת. דלקת כתוצאה ממוות נקרוטי מגביר את הרעילות, ומקדם פיברוזיס שרירים ואובדן של תפקוד השריר11,12. טיפולים כיום בניסויים קליניים מיקוד השורשים של הפרעות ניווניות שרירים, כגון ריפוי גנטי, צפויים להקל על התרופות. טכניקות פשוטות כדי בדיוק לכמת ניוון שרירים הם נדרשים לכן.
מספר שיטות משמשות באופן שגרתי כדי לפקח על אובדן מיוסיבי בvivo. המדידה של הפעילות האנזימטית של קריאטין קינאז (CK) בדם מאפשרת כימות אמין של נמק מתמשך ברקמות השריר והלב. באתרו, haematoxylin ו אאוזין (H & E) כתמים היא השיטה הפופולרית ביותר כיום בשימוש באבחון להעריך ניוון-התחדשות שיפוץ. עם זאת, הבסיס המולקולרי של התוויות H & E של תאים מתים נשאר ברור. יתר על כן, שינויים צבע להציע מוות מיוסיבי ב H & E כתמים הם עדינים יחסית לא להקל על כימות אמין והזדהות. שיטות חשיפת הפיצול DNA, כגון הטרמינל deoxynucleotidyl מעביר dUTP לסיים את התוויות (TUNEL), באופן מושלם התווית נמק מוות3. הם גם מותאמים בצורה גרועה כדי לפקח על מותם של התאים הסינציוניים כגון סיבים מיועם. הזרקה של צבעים חיוניים, כגון הצבע הכחול של אוון (EBD), מייצגת חלופה שימושית להערכת סיבים מיומיים שאיבדו את השלמות של sarcolemma, אבל הוא לא בהכרח נוח בכמה פרוטוקולים ניסיוניים. למשל, הנוכחות של EBD בדגימות דם יכולה להשפיע על תוצאות של מדידות CK, שיטת צביעה במדד. יתר על כן, ספיגת תאיים של EBD הופך שיתוף immunolabelling מאתגרת. לכן, שיטה חלופית המאפשרת תיוג ישיר של סיבים מיוים שעוברים נמק הוא עניין.
המנגנון של פעולה של צבעים חיוניים מסתמך על אובדן של שלמות הממברנה פלזמה ב נמק מיוטיות ואת ספיגת פסיבי של הצבע המוזרק. באופן דומה, נמק מיוכי סיבים לספיגת חלבונים בדם כגון אלבומין, אשר ebd יש זיקה חזקה13,14, אימונוגלובולין G (igg), ו-igg15. הנוכחות החריגה של חלבונים בדם בתוך מיוסיבים ולכן מייצגת סמנים נוחים ליוווליזיס באתרו. צביעת חלבונים אלה יכולה להיות חלופה לשימוש בצבעים חיוניים.
באמצעות ספיגת IgG כסמן של מצוי באתרו, פרוטוקול זה משמש כדי להעריך ניוון שרירים בחלק הקדמי הפיזי (TA) של עכבר mdx הדיסטרופין לקוי. שיטה זו מציגה יתרונות משמעותיים על-פני טכניקות חלופיות: 1) היא מהווה הוצאה לדרך ופשוטה בביצועה; 2) זה לא דורש שום טיפול בעלי חיים לפני איסוף שרירים, כגון הזרקה של במחזור צבעים חיוניים, ו 3) כמו החיסונית המקובלת כל, הוא תואם עם תוויות שכונתיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
נמק מיוסיבי הוא תוצאה נפוצה של התעמלות טראומטית בשרירים נורמליים. הוא מפוצה היטב על ידי קיבולת משובי חזקה של ושלתי השריר המקומי. עם זאת, בכמה מצבים שרירים כגון ב MDs, יכולת ההתחדשות של תאי לווין נפגעת על ידי מחלות כרוניות ופיברוזיס מוגזמת. הממצאים האחרונים מראים כי סיבי השריר יכול למות על יד?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה הצרפתית הMyopathies עם התוכנית Translamuscle. המחברים מודים לד ר פרלה רייס-פרננדז וד ר מתיו בורבוק על הקריאה הזהירה של כתב היד.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
