Immunolabelling Degenerazione di mitragliari nelle biopsie muscolari
Summary
Descritto qui è un protocollo per l’immunolabelling diretto delle minofibre necrotiche nelle criosezioni muscolari. Le cellule necrotiche sono permeabili alle proteine del siero, tra cui l’immunoglobulina G (IgG). Rivelare l’assorbimento di IgG da miofibre permette l’identificazione e la quantificazione delle miofibre che subiscono necrosi indipendentemente dalla condizione muscolare.
Abstract
La necrosi delle fibre muscolari (mionecrosi) svolge un ruolo centrale nella patogenesi di diverse condizioni muscolari, tra cui le distrofie muscolari. Le opzioni terapeutiche che affrontano le cause della patogenesi della distrofia muscolare dovrebbero alleviare la degenerazione muscolare. Pertanto, è necessario un metodo per testare e quantificare l’estensione della morte cellulare nelle biopsie muscolari. I metodi convenzionali per osservare la degenerazione della miofibra in situ sono scarsamente quantitativi o si basano sull’iniezione di coloranti vitali. In questo articolo, viene descritto un protocollo di immunofluorescenza che macchia le miofibre necrotiche prendendo di mira l’assorbimento dell’immunoglobulina G (IgG) da parte delle miofibre. Il metodo di assorbimento IgG si basa su caratteristiche cellulari che caratterizzano la scomparsa necrotica, tra cui 1) la perdita di integrità della membrana plasmatica con il rilascio di modelli molecolari associati ai danni e 2) l’assorbimento di proteine plasmatiche. Nelle sezioni trasversali murine, la co-immunolabelling di miofibre, proteine a matrice extracellulare e IgG di topo consente un’identificazione pulita e diretta delle miofibre con il destino necrotico. Questo semplice metodo è adatto per l’analisi quantitativa e applicabile a tutte le specie, compresi i campioni umani, e non richiede l’iniezione di tinri vitali. La colorazione delle miofibre necrotiche da parte dell’assorbimento DiGG può anche essere abbinata ad altre co-immunolabelling.
Introduction
Il muscolo scheletrico è costituito principalmente da fibre muscolari (miofibre), responsabili della caratteristica funzione contrattuale volontaria. Queste cellule sono multinucleate, strutture post-mitotiche che supportano lo stress meccanico che si verificano durante la contrazione. La stabilità strutturale della membrana della miofibra (sarcolemma) e della sua matrice extracellulare sono cruciali per l’omeostasi dei tessuti. Le cellule satellitari costituiscono la principale popolazione progenitrice muscolare nel muscolo scheletrico maturo ed esistono in uno stato quiescente nei muscoli sani. Dopo la morte della miofibra, la rigenerazione muscolare è supportata da cellule satellitari a seguito di un programma miogenico che prevede l’attivazione, la proliferazione, la differenziazione e la fusione delle cellule satellitari per formare in ultima analisi nuove miofibre multinucleate.
La scomparsa della mionina può verificarsi in più condizioni muscolari, tra cui traumi meccanici, lesioni da ischemia-reperfusione, o distrofie muscolari, ed è associata alla morfologia necrotica delle cellule morte1,2. La morte necrotica è caratterizzata dalla rapida permeabilità della membrana plasmatica e dal rilascio del contenuto cellulare nel compartimento extracellulare3. Può derivare da un processo non regolamentato che non comporta una corretta segnalazione cellulare (cioè necrosi accidentale) o da un percorso intracellulare orchestrato (cioè necrosi regolamentata). Nelle miofibre, sia regolato4 e non regolamentato5 processi possono portare alla necrosi. Una conseguenza tipica della miocrosi è il rilascio di modelli molecolari associati ai danni, attivando una potente risposta infiammatoria6. La presenza di macrofagi è osservata a circa 48 h e 72 h a seguito della lesione7. Oltre al loro ruolo nella distanza dei detriti necrotici, sono importanti anche nella rigenerazione muscolare8,9.
Le distrofie muscolari (MD) sono un gruppo eterogeneo di patologie che spesso derivano da un difetto nella struttura del sarcolemma. La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia giovanile legata all’X che colpisce circa 1 su ogni 3.500 nascite maschilidetutto il mondo, ed è causata dall’assenza di espressione distrofina al sarcolemma. La degenerazione cronica del tessuto muscolare nei ragazzi della DMD porta a una debolezza muscolare estrema e alla mortalità precoce. L’infiammazione derivante dalla morte necrotica migliora la citotossicità e favorisce la fibrosi muscolare e la perdita della funzione muscolare11,12. Si prevede che i trattamenti attualmente in sperimentazione clinica che colpiscono le radici dei disturbi degenerativi muscolari, come la terapia genica, alleviano la mioonecrosi. Sono quindi necessarie tecniche semplici per quantificare con precisione la degenerazione muscolare.
Diversi metodi sono regolarmente utilizzati per monitorare la perdita di miofibra in vivo. La misurazione dell’attività enzimatica della creatina chinasi (CK) nel sangue consente una quantificazione affidabile della necrosi in corso nei tessuti muscolari e cardiaci. In situ, la colorazione ematossia e eosina (H&E) è il metodo più popolare attualmente utilizzato nella diagnosi per valutare il rimodellamento della rigenerazione degenerazione. Tuttavia, la base molecolare dell’etichettatura H&E delle cellule morte rimane poco chiara. Inoltre, le modifiche del colore che suggeriscono la morte della miofibra nella colorazione H&E sono relativamente sottili e non facilitano la quantificazione affidabile e riproducibile. Metodi che rivelano la frammentazione del DNA, come il transfersasi dUTP nick end labelling (TUNEL) del deossinucleotidicolo terminale, la morte necroticaimperfetta 3. Sono anche scarsamente adattati per monitorare la morte di cellule sinciziali come le miofibre. L’iniezione di coloranti vitali, come la tinta blu di Evan (EBD), rappresenta un’utile alternativa per valutare le miofibre che hanno perso l’integrità del sarcolemma, ma non è necessariamente conveniente in alcuni protocolli sperimentali. Ad esempio, la presenza di EBD nei campioni di sangue può influenzare i risultati delle misurazioni CK, un test colorimetrico. Inoltre, l’assorbimento intracellulare di EBD rende difficile la co-immunolabelling. Pertanto, un metodo alternativo che consente l’etichettatura diretta delle miofibre sottoposte a necrosi è di interesse.
Il meccanismo d’azione dei coloranti vitali si basa sulla perdita dell’integrità della membrana plasmatica nelle mitraglie necrotiche e sull’assorbimento passivo del coloranti iniettato. Allo stesso modo, le miofibre necrotiche assorbono proteine del sangue come l’albumina, per le quali EBD ha una forte affinità13,14, immunoglobuina G (IgG) e IgM15. La presenza anomala di proteine ematiche all’interno delle miofibre rappresenta quindi marcatori convenienti per la mionecrosi in situ. Colorare queste proteine può essere un’alternativa per l’uso di coloranti vitali.
Utilizzando l’assorbimento di IgG come marcatore della miocrosi in situ, questo protocollo viene utilizzato per valutare la degenerazione muscolare nel tibialis anteriore (TA) di topi mdx distrophin-carenti. Questo metodo presenta vantaggi significativi rispetto alle tecniche alternative: 1) è riproducibile e semplice nella sua esecuzione; 2) non richiede alcun trattamento animale prima della raccolta muscolare, come l’iniezione di coloranti vitali circolanti, e 3) come qualsiasi immunoetichettatura convenzionale, è compatibile con la co-etichettatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La necrosi della miofibra è una conseguenza comune dell’esercizio traumatico nei muscoli normali. È ben compensato da una potente capacità rigenerativa dei progenitori muscolari locali. Tuttavia, in diverse condizioni muscolari come nelle MD, la capacità rigenerativa delle cellule satellitari è compromessa dalla miocrosi cronica e dall’eccessiva fibrosi. Recenti scoperte mostrano che le fibre muscolari possono morire per necroptosi, una forma regolamentata di necrosi. Più specificamente, l’inibizione della necropto…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’Associazione Francese contre les Myopatie con il programma Translamuscle. Gli autori ringraziano il Dr. Perla Reyes-Fernandez e il Dr. Matthew Borok per la loro attenta lettura del manoscritto.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
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