Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares
Summary
Descrito aqui é um protocolo para imunorotulagem direta de miofibras necróticas em criosecções musculares. As células necróticas são permeáveis para as proteínas séricas, incluindo a imunoglobulina G (IgG). Revelar a captação de IgG por miofibras permite a identificação e quantificação de miofibras que sofrem necrose, independentemente da condição muscular.
Abstract
A necrose das fibras musculares (mionecrose) desempenha um papel central na patogênese de várias condições musculares, incluindo distrofias musculares. Espera-se que as opções terapêuticas que abordem as causas da patogênese da distrofia muscular aliviem a degeneração muscular. Portanto, um método para ensaio e quantificar a extensão da morte celular em biópsias musculares é necessário. Métodos convencionais para observar a degeneração da miofibra in situ são pouco quantitativos ou dependem da injeção de corantes vitais. Neste artigo, um protocolo de imunofluorescência é descrito que mancha miofibras necróticas, visando a captação de imunoglobulina G (IgG) por miofibras. O método de captação de IgG é baseado em características celulares que caracterizam a morte necrótica, incluindo 1) a perda de integridade da membrana plasmática com a liberação de padrões moleculares associados a danos e 2) a captação de proteínas plasmáticas. Nas seções transversais de urina, a co-imunorotulagem de miofibras, proteínas de matriz extracelular e o mouse IgG permite a identificação limpa e direta das miofibras com destino necrótico. Este método simples é adequado para análise quantitativa e aplicável a todas as espécies, incluindo amostras humanas, e não requer a injeção de tinudura vital. A coloração de miofibras necróticas pela captação de IgG também pode ser emparelhada com outras co-imunorotulagem.
Introduction
O músculo esquelético estriado consiste principalmente em fibras musculares (miofibras), que são responsáveis pela função contélica voluntária característica. Essas células são estruturas multinucleadas e pós-mitocômicas que suportam o estresse mecânico ocorrendo durante a contração. A estabilidade estrutural da membrana de miofibra (sarcolemia) e sua matriz extracelular são cruciais para a homeostase do tecido. As células de satélite compreendem a principal população de progenitores musculares no músculo esquelético maduro e existem em estado quiescente em músculos saudáveis. Após a morte por miofibra, a regeneração muscular é apoiada por células via satélite após um programa miogênico que envolve ativação de células via satélite, proliferação, diferenciação e fusão para, em última análise, formar novas miofibras multinucleadas.
A morte da miofibra pode ocorrer em múltiplas condições musculares, incluindo trauma mecânico, lesões de isquemia-reperfusão ou distrofias musculares, e está associada à morfologia necrótica das células mortas1,2. A morte necrótica é caracterizada pela permeabilidade rápida da membrana plasmática e liberação de conteúdo celular no compartimento extracelular3. Pode resultar de um processo não regulamentado que não envolva nenhuma sinalização celular adequada (ou seja, necrose acidental) ou de uma via intracelular orquestrada (ou seja, necrose regulada). Em miofibras, ambos regulamentados4 enão regulamentados 5 processos podem levar à necrose. Uma conseqüência típica da mioneconese é a liberação de padrões de moléculas associados a danos, ativando uma poderosa resposta inflamatória6. A presença de macrófagos é observada em torno de 48 h e 72 h após lesão7. Além de seu papel na limpeza de detritos necróticos, eles também são importantes na regeneração muscular8,9.
Distrofias musculares (DM) são um grupo heterogêneo de patologias que muitas vezes resultam de um defeito na estrutura da sarcolema. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença juvenil ligada ao X que afeta aproximadamente 1 em cada 3.500 nascimentos masculinos em todo o mundo10,e é causada pela ausência de expressão de distrofina na sarcolema. A degeneração crônica do tecido muscular em meninos dmd leva a extrema fraqueza muscular e mortalidade precoce. Inflamação resultante da morte necrótica aumenta a citotoxicidade, e promove a fibrose muscular e a perda da função muscular11,12. Tratamentos atualmente em ensaios clínicos visando as raízes de distúrbios degenerativos musculares, como a terapia gênica, são esperados para aliviar a mioneconese. Técnicas simples para quantificar com precisão a degeneração muscular são, portanto, necessárias.
Vários métodos são rotineiramente usados para monitorar a perda de miofibra in vivo. A medição da atividade enzimática da cineza de creatina (CK) no sangue permite quantificação confiável da necrose contínua nos tecidos musculares e cardíacos. In situ, a coloração hematoxilina e eosina (H&E) é o método mais popular usado atualmente no diagnóstico para avaliar a remodelação da regeneração da degeneração. No entanto, a base molecular da rotulagem de H&E das células mortas ainda não está clara. Além disso, modificações de cor que sugerem morte por miofibra na coloração de H&E são relativamente sutis e não facilitam a quantificação confiável e reproduzível. Métodos que revelam a fragmentação do DNA, como o terminal desoxinucleotidyl transferase dUTP nick end labelling (TUNEL), imperfeitamente rotular morte necrótica3. Eles também são mal adaptados para monitorar a morte de células sincrial, como miofibras. A injeção de corantes vitais, como o corante azul de Evan (EBD), representa uma alternativa útil para avaliar miofibras que perderam a integridade da sarcolema, mas não é necessariamente conveniente em alguns protocolos experimentais. Por exemplo, a presença de EBD em amostras de sangue pode afetar os resultados das medições de CK, um ensaio colorimétrico. Além disso, a adposição intracelular de EBD torna a co-imunorotulagem desafiadora. Portanto, um método alternativo que permite a rotulagem direta das miofibras submetidas à necrose é de interesse.
O mecanismo de ação de corantes vitais depende da perda da integridade da membrana plasmática em miofibras necróticas e da captação passiva do corante injetado. Da mesma forma, as miofibras necróticas captam proteínas do sangue, como a albumina, para a qual a EBD tem uma forte afinidade13,14, imunoglobulina G (IgG) e IgM15. A presença anormal de proteínas do sangue dentro de miofibras, portanto, representa marcadores convenientes para mioneconese in situ. Manchar estas proteínas pode ser uma alternativa para o uso de corantes vitais.
Usando a captação de IgG como um marcador da mioneconese in situ, este protocolo é usado para avaliar a degeneração muscular no tibialis anterior (TA) de camundongos deficientes em distrophina mdx. Este método apresenta vantagens significativas sobre técnicas alternativas: 1) é reproduzível e simples em sua execução; 2) não requer qualquer tratamento animal antes da coleta muscular, como a injeção de corantes vitais circulantes, e 3) como qualquer imunorotulagem convencional, é compatível com a co-rotulagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Necrose da miofibra é uma conseqüência comum do exercício traumático em músculos normais. É bem compensado por uma poderosa capacidade regenerativa dos progenitores musculares locais. No entanto, em várias condições musculares, como em DMs, a capacidade regenerativa das células de satélite é comprometida pela mioneconese crônica e fibrose excessiva. Os resultados recentes mostram que as fibras musculares podem morrer por necroptose, uma forma regulada de necrose. Mais especificamente, a inibição da necrop…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Associação Française contre les Myopathies com o programa Translamuscle. Os autores agradecem ao Dr. Perla Reyes-Fernandez e ao Dr. Matthew Borok por sua leitura cuidadosa do manuscrito.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
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