Målet med denna artikel är att beskriva de steg som krävs för generering av fibriller från monomer alfa-Synuclein, efterföljande kvalitets kontroll, och användning av de förformade fibriller in vivo.
Användning av in vivo alfa-Synuclein förformade fibrillcellulosa (α-syn PFF) modell av synucleinopati ökar i popularitet bland forskare som syftar till att modellera Parkinsons sjukdom synucleinopati och nigrostriatala degeneration. Standardiseringen av α-syn PFF-generering och in vivo-applicering är kritisk för att säkerställa en konsekvent, robust α-syn-patologi. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för generering av fibriller från monomer α-syn, post-fibrilization kvalitets kontroll steg, och föreslog parametrar för framgångs rik Neurokirurgisk injektion av α-syn PFFs till råttor eller möss. Från och med monomer α-syn sker fibrillering under en 7-dagars inkubations tid under skakningen vid optimala buffertförhållanden, koncentration och temperatur. Efter fibrilization kvalitets kontroll bedöms av närvaron av pelletable fibriller via sedimentering assay, bildandet av amyloid kon formation i fibriller med en tioflavin T-analys, och elektron mikroskopisk visualisering av fibriller. En lyckad validering med hjälp av dessa analyser är nödvändig för att lyckas, de är inte tillräckliga för att garantera att PFFs kommer att frön α-syn inne slutningar i nerv celler, eftersom sådan agg regering aktivitet av varje PFF parti bör testas i cell kultur eller i pilot djur kohorter. Före användning måste PFFs vara sonicated under exakt standardiserade förhållanden, följt av undersökning med elektronmikroskopi eller dynamisk ljus spridning för att bekräfta fibrillcellulosa längder är inom optimal storleks intervall, med en genomsnittlig längd på 50 nm. PFFs kan sedan tillsättas till cell odlings medier eller användas i djur. Patologi detekterbar genom immuninfärgning för fosforylerat α-syn (psyn; serin 129) är uppenbara dagar eller veckor senare i cell kulturer respektive gnagare.
Parkinsons sjukdom (PD) kännetecknas främst efter döden av två stora patologiska egenskaper: utbredd och progressiv alfa-Synuclein (α-syn) patologi, och nigrostriatala degeneration. Efter injektion i wildtyp möss eller råttor, α-syn förformade fibriller (PFFs) inducera progressiv ansamling av patologiskt α-syn, vilket kan resultera i utdragen degeneration av substantia nigra pars compacta (SNpc) dopamin nerv celler under loppet av många samt sensorimotoriska underskott1,2,3,4,5,6. Neuroner utsätts för α-syn fibriller, antingen via direkt Intracerebral injektion eller läggas till media av odlade nerv celler. När PFFS tas in i nerv celler, den PFFS agera för att “frö” bildandet av inne slutningar genom Templating, och ackumulering av endogena α-syn till fosforylerade inne slutningar1,7,8, och 9. Inne slutningar har liknande egenskaper som Lewy organ: innehåll ande α-syn fosforylerat vid serin 129 (pSyn), ubiquitin och P62; inneha aamyloida Kvartära strukturer som visas med positiv färgning av tioflavin; och är resistenta mot proteinas K mat smältning1,3,5,7,8,9,10,11, med 12. PFF exponering leder till α-syn inkludering bildandet i primär och några förevigas nerv celler i kulturen, samt möss, råttor och icke-mänskliga primater in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Det är viktigt att notera att PFFs inte kommer att leda till α-syn inkludering formation i alla cell kulturer modeller och vissa odlade nerv celler kommer utsäde bättre än andra.
En annan viktig egenskap hos in vivo α-syn PFF-modellen är de distinkta sekventiella patologiska faser som uppstår under flera månader. I gnagare, efter intrastriatal injektion, α-syn inklusion bildas generellt inom SNpc och många kortikala regioner inom 1-2 månader. Denna agg regering topp följs av nigrostriatala degeneration ≈ 2-4 månader senare1,3,5. Dessa distinkta patologiska stadier ger forskarna den plattform som man kan studera och utveckla strategier som 1) minska α-syn aggregation, 2) klart redan bildade α-syn inne slutningar, och/eller 3) förhindra efterföljande neurodegeneration. Den PFF modellen erbjuder distinkta fördelar och nack delar jämfört med neurotoxicant, transgena, och viral vektor medierad α-syn överuttryck modeller som tidigare granskat6. Valet av vilken modell eller metod att ta bör bestämmas av vilken modell som bäst passar den fråga som utredarna efterfrågar.
Även om PFF-modellen har framgångs rikt använts av många laboratorier, det finns fortfarande grupper som har upplevt inkonsekvenser med att generera fibriller och producerar konsekvent α-syn patologi14. Exempel på inkonsekvenser varierar från PFFs som producerar liten eller ingen α-syn patologi, batch till batch seedning effektivitet, och även fel i fibriller att bilda. Därför är standardiseringen av α-syn PFF-generationen och in vivo-applicering kritisk för att möjliggöra korrekta tolkningar av effekten av nya terapeutiska ingrepp. Följande protokoll beskriver de steg som krävs för generering av PFFs från α-syn monomerer, in vitro kvalitets kontroll av PFFs en gång bildades, ultraljudsbehandling och mätning av PFFs före användning, och förslag för att under lätta framgångs rik in vivo injektion av PFFs till råttor eller möss.
Produktion av α-syn PFFs kan sådd neuroner och leder till Lewy Body-liknande inne slutningar är beroende av flera faktorer och steg. En kritisk faktor är att monomerer som används för att generera fibriller måste vara specifikt formulerade för fibrilization4,9,14,15. Om monomererna inte är formulerade för fibrilization, fibriller kan inte bildas eller fibriller som gör form får inte producera α-syn patologi. Likaså, den buffert som monomererna är i också påverka fibrilization. Som sådan, för bästa resultat, salt koncentrationen bör vara cirka 100 mM NaCl och pH mellan 7,0 och 7,3. Ett första steg som introducerar variation är den metod där initial protein halt bestäms, med mätning på A280 sannolikt att producera mer exakta resultat och därför är den föredragna metoden. Skillnaden i protein koncentration kan minska effekten av fibrilization processen, samt ändra den antagna PFF koncentrationen används i experiment. Båda kan leda till en minskning av sådd effektivitet och batchvariation mellan experiment.
Inledande kvalitets kontroll steg kommer att bekräfta kritiska egenskaper hos PFFs, särskilt att de har en fibrillär kon formation (elektronmikroskopi), innehåller amyloid strukturer (tioflavin T-analys), och är pelletable (sedimentation analys). Det är viktigt att notera att resultaten av thioflavin T-analysen kommer att fluktuera med tiden och är inte ett direkt mått på mängden av amyloid strukturer närvarande, snarare, thioflavin T-analysen bör endast användas som en indikator på amyloid strukturer närvaro inom provet. Thioflavin T används vanligt vis i in vitro-analyser, såsom den ovan nämnda analysen för att Visa fibriller innehåller amyloid strukturer. Alternativt, tioflavin S används i vävnad för att upptäcka amyloid strukturer, som visas i figur 7. När det gäller sedimenteringstest, visar resultaten endast att PFFs finns huvudsakligen i pelletable fraktion. Eftersom proverna körs i denaturering villkor, en enda framstående band av cirka 14 kDa, storleken på α-syn monomerer, finns på gelerna. Detta är till skillnad från de flera band som finns på högre molekyl vikter som skulle förväntas med PFFs om en infödd eller icke-denaturering gel användes. Slutligen garanterar lyckad överföring av alla dessa inledande kvalitets kontroll steg inte α-syn inkludering aktivitet. Av denna anledning, cell kultur experiment eller en liten kohort av kirurgiskt injicerade djur bör användas för att testa effekten av PFFs före användning i större experiment.
Ultraljudsbehandling är ett avgörande steg i processen och parametrarna kommer att variera beroende på modell av någon sonikator används. Ultraljudsbehandling parametrar måste tillämpas och verifieras för att visa att korta PFF fragment har producerats. Fibril storlek har betydelse för seedning, med kortare fibriller seedning mer effektivt. Även kortare fibriller utsäde mer effektivt, denna effekt platåer och den optimala PFF längd är cirka 50 nm4,18. Det är också viktigt att inte över-Sonikera proverna och exponera PFFs till överdriven värme, eftersom detta kan minska seedning effektivitet. Dessa sonicated PFFs bör testas för effekt i liten cell kultur eller in vivo experiment före användning i större skala experiment. Som olika ultraljudsbehandling sessioner har potential att införa variation, experimentella behandlings grupper bör planeras i enlighet med detta.
Vid leverans av PFFS in vivo, lokalisering av injektions stället (s) och den totala mängden PFFS används kan påverka antalet nerv celler som kommer att utveckla inne slutningar samt omfattningen av neurodegeneration7,14. Koordinaterna i protokollet ger en plats att starta, men bör testas i labbet för att säkerställa att önskad mål region utvecklar α-syn patologi före användning i storskaliga experiment. Om så önskas kan spårnings färg eller fluorescerande pärlor användas som ett sätt att testa regional inriktning innan du använder PFFs. Mängden PFFS som används i vivo varierar mellan grupperna, där de flesta grupper använder en total summa mellan 5 och 20 μg PFFS på en eller uppdelad mellan två injektions ställen1,2,3,4,5 , 6 att ha , 7 för att , 14. eftersom antalet injektions ställen, placeringen av injektions ställena och mängden PFFS som injicerats kan leda till resultat och progression av synucleinopati, bör resultaten av de parametrar som används i efterföljande led karakteriseras före användning av modellen för att testa potentiella interventioner eller undersöka tidsmässiga särdrag i modellen.
När man väljer en modell som ska användas för att testa terapier eller studera sjukdomsprogression, bör den modell som används väljas för att bäst besvara frågan. Inte alla modeller kommer att ha vissa sjukdoms egenskaper hos PD, eller erbjuda den tidsram som behövs för att testa potentiella interventioner. Den PFF modell recapitulates nyckel dragen av PD, sådan som α-syn patologi och neurodegeneration, och kanna leda till blygsam motor försämringar. Modellen erbjuder en förutsägbar och utdragen tid-kurs, där inne slutningar form månader före neurodegeneration. Detta gör det möjligt för forskare att undersöka och utnyttja de olika faserna under den långvariga utvecklingen av synucleinopati. Den nuvarande och framtida användningen av modellen övergripande förväntas vara fördelaktigt i studiet av sjukdomsprogression och utveckling av nya terapier.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av bidrag från Michael J. Fox Foundation, National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NS099416) och Weston Brain Institute.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |