הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative
Summary
המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.
Abstract
כלי הדם מinnervate את כל הרקמות בחוליות, ומאפשרים את הישרדותה על ידי מתן החומרים המזינים, החמצן והאותות ההורמונליים הנחוצים. זהו אחד האיברים הראשונים להתחיל לתפקד במהלך הפיתוח. מנגנונים של היווצרות כלי הדם הפכו להיות נושא של עניין מדעי וקליני גבוה. אצל מבוגרים עם זאת, קשה לדמיין את היום ברוב חיות החיים בשל הלוקליזציה שלהם עמוק בתוך רקמות אחרות. עם זאת, הדמיה של כלי הדם ממשיכה להיות חשובה למספר מחקרים כגון אנדוקרינולוגיה ונוירוביולוגיה. בעוד כמה קווים טרנסגניים פותחו ב zebrafish, עם כלי הדם לדמיין ישירות דרך הביטוי של חלבונים פלורסנט, אין כלים כאלה קיימים עבור מינים teleost אחרים. הפרוטוקול הנוכחי מציג טכניקה מהירה וישירה כדי לתייג כלי דם במוח ובבלוטת יותרת, באמצעות השימוש בשיטת “הצדקה” (Oryzias) כמודל. פרוטוקול זה מאפשר שיפור של ההבנה שלנו על איך בתאי המוח ובלוטת ההיפופיזה לקיים אינטראקציה עם דם ובללטורה ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.
Introduction
כלי הדם משחקים חלק חיוני של הגוף בעלי החוליות כפי שהם מספקים את החומרים המזינים הדרושים, חמצן ואותות הורמונליים לכל האיברים. גם, מאז התגלית של המעורבות שלהם בפיתוח סרטן1, הם קיבלו הרבה תשומת לב במחקר קליני. למרות שמספר פרסומים חקרו את המנגנונים המאפשרים צמיחה של כלי דם ומורפולגנזה, ומספר רב של גנים חשובים להיווצרות שלהם זוהו2, הרבה נשאר להבין בקשר לאינטראקציה בין תאים או רקמות לדם מחזורי.
, ויזואליזציה של דם ובלוטת יותרת המוח. זה חשוב נוירונים במוח דורשים אספקת גבוהה של חמצן וגלוקוז3, ואת בלוטת ההיפופיזה מכיל עד שמונה סוגי תאים חשובים הורמון מייצר המשתמשות זרימת הדם כדי לקבל אות מהמוח ולשלוח הורמונים שלהם שונים איברים היקפיים4,5. בעוד ביונקים, מערכת הפורטל בבסיס של ההיפותלמוס בשם הוד רוממותו, מקשרת את המוח ואת בלוטת ההיפופיזה6, כגון גשר דם ברור לא תוארה ב teleost דגים. אכן, ב teleosts, preoptico-הנוירונים היפוטתלמי ישירות פרויקט אקסונים שלהם לתוך pars נרבוזה של בלוטת יותרת7 ובעיקר innervate סוגי תאים האנדוקרינית שונים ישירות8,9. עם זאת, כמה נוירונים אלה יש קצות העצבים שלהם ממוקם בחלל extravascular, בקרבת מקום נימים בדם10. לכן, ההבדל בין הדגים teleost ויונקים הוא לא כל כך ברור, ואת הקשר בין הדם ובדיקת המוח ואת התאים בלוטת ההיפופיזה דורש חקירה גדולה יותר של הדגים teleost.
Zebrafish יש, בהיבטים רבים, מערכת כלי דם המקבילה מבחינה אנטומית ופונקציונלית למינים אחרים בעלי חוליות11. זה הפך למודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור מחקר לב וכלי דם בעיקר בזכות הפיתוח של קווים טרנסגניים מספר שבו מרכיבים של מערכת כלי הדם מסומנים עם חלבונים כתבת פלורסנט12. עם זאת, אנטומיה מדויקת של מערכת הדם עשויה להשתנות בין מינים, או אפילו בין שני אנשים השייכים לאותו מינים. לכן, הדמיה של כלי הדם עשויה להיות בעלת עניין רב גם במינים אחרים של teleost שבהם כלים טרנסגנזה אינם קיימים.
מספר טכניקות תוארו לתייג כלי דם בשני היונקים והטלאוסטים. אלה כוללים היברידיזציה באתרו עבור גנים ספציפיים ואסילטורה, כתמים הזרחן אלקליין, microangiography, וזריקות צבע (עבור סקירה ראה13). ליפולי פלורסנט indocarbocyanine צבען (dii) השתמשו לראשונה כדי ללמוד ממברנה לאורך ניידות לרוחב כפי שהוא נשמר bilayers ליפיד והוא יכול להעביר דרך זה14,15,16. ואכן, מולקולה של DiI מורכבת משתי שרשראות פחמנים וכרומואופהורס. בעוד שרשראות פחממים לשלב את קרום התא bilayer השומנים של התאים במגע עם זה, ראשון להישאר על פני השטח שלה17. פעם אחת בקרום, מולקולות DiI לפזר בתוך השומנים bilayer שעוזר להכתים מבנים ממברנה כי הם לא במגע ישיר עם פתרון DiI. הזרקת פתרון DiI דרך הפרזיה לב, ולכן מתייג את כל תאי האנדותל במגע עם התרכובת המאפשרת תיוג ישיר של כלי הדם. היום DiI משמש גם למטרות כתמים אחרים, כגון הדמיה מולקולה אחת, מיפוי הגורל, ומעקב עצבי. מעניין, מספר fluorophores קיים (עם אורכי גל שונים של פליטה) המאפשר את השילוב עם תוויות פלורסנט אחרות, ואת התאגדות, כמו גם את הדיפוזיה לרוחב של DiI יכול להתרחש הן לחיות וקבוע רקמות18, . בן 19
פורמלדהיד, התגלה על ידי פרדיננד בלום ב-1893, שימש באופן נרחב ליום הנוכחי ככימיקל המועדף לקיבוע רקמות20,21. הוא מראה ספציפיות למרבית היעדים הסלולאריים ומשמר את המבנה התאי22,23. הוא גם שומר על תכונות פלורסנט של רוב fluorophores, ובכך ניתן להשתמש כדי לקבוע בעלי חיים טרנסגניים שבהם תאים ממוקדות לבטא העיתונאי פלורסנט חלבונים.
בכתב יד זה, פרוטוקול קודם שפותח כדי לתייג כלי דם בדגמי יונקים קטנים וניסיוניים24 הותאם לשימוש בדגים. ההליך כולו לוקח רק כמה שעות לבצע. זה מדגים כיצד לעשות פתרון קבע של פורמלדהיד המכיל dii בלב הדג כדי לתייג ישירות את כל כלי הדם במוח ואת בלוטת ההיפופיזה של הדג המודל הצדקה. מאקה הוא דג מים מתוקים קטן יליד אסיה, שנמצא בעיקר ביפן. זה אורגניזם מודל מחקר עם חבילה של כלים מולקולריים וגנטיים זמינים25. לכן, זיהוי כלי הדם במין זה כמו גם באחרים יאפשר לשפר את ההבנה שלנו על איך המוח ואת התאים בבלוטת ההיפופיזה אינטראקציה עם דם ובלוטת הדם ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרזיה לב עם DiI בעבר השתמשו כדי לתייג כלי דם במספר מיני דגם24, כולל teleost דגים13.
כפי dii מועברת ישירות קרום התא אנדותל על ידי זלוף ב vasculature ניתן להגדיל את היחס אות אל הרעש על ידי הגברת ריכוז dii בפתרון הקבע. בנוסף, fluorophore מספק מכתים אינטנסיבי כאשר מתרג?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד ר שינג קאנדה להדגמה של מיזוג לב עם פתרון מתואם במיאקה, גברת לאורדז קארב ג’י טאן לקבלת עזרה בנוגע לטיפול בצדקה, ומר אנתוני פלטייר לאיורים. עבודה זו ממומנת על ידי NMBU ועל ידי מועצת המחקר של נורבגיה, גרנט מספר 248828 (התוכנית הדיגיטלית נורווגיה).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. . Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Biologie du développement. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochimie. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
