Etikettering van bloedvaten in de Teleost hersenen en de hypofyse met behulp van cardiale transfusie met een DiI-fixatief
Summary
Het artikel beschrijft een snel protocol voor het etiketteren van bloedvaten in een Teleost vis door cardiale transfusie van DiI verdund in fixatief, met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model en gericht op de hersenen en de hypofyse weefsel.
Abstract
Bloedvaten innervate alle weefsels in gewervelde dieren, waardoor hun overleving door het verstrekken van de nodige voedingsstoffen, zuurstof en hormonale signalen. Het is een van de eerste organen die beginnen te functioneren tijdens de ontwikkeling. Mechanismen van de vorming van bloedvaten zijn uitgegroeid tot een onderwerp van hoge wetenschappelijke en klinische belangstelling. Bij volwassenen is het echter moeilijk om de vasculatuur te visualiseren in de meeste levende dieren als gevolg van hun lokalisatie diep in andere weefsels. Niettemin, visualisatie van de bloedvaten blijft belangrijk voor verschillende studies, zoals endocrinologie en Neurobiology. Terwijl verschillende transgene lijnen zijn ontwikkeld in zebravis, met bloedvaten direct gevisualiseerd door middel van expressie van fluorescerende eiwitten, geen dergelijke instrumenten bestaan voor andere Teleost soorten. Met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model, het huidige protocol presenteert een snelle en directe techniek om de bloedvaten label in de hersenen en de hypofyse door perfusing door het hart met fixatief met DiI. Dit protocol maakt de verbetering van ons begrip over hoe de hersenen en de hypofyse cellen interageren met bloed vasculatuur in hele weefsel of dikke plakjes weefsel.
Introduction
Bloedvaten spelen een essentieel onderdeel van het gewervelde lichaam als ze de nodige voedingsstoffen, zuurstof en hormonale signalen te verstrekken aan alle organen. Ook, sinds de ontdekking van hun betrokkenheid bij de ontwikkeling van kanker1, hebben ze veel aandacht gekregen in klinisch onderzoek. Hoewel een aantal publicaties de mechanismen hebben onderzocht die de groei en de morfogenese van de bloedvaten mogelijk maken, en een groot aantal genen belangrijk voor hun vorming zijn geïdentificeerd2, nog veel te begrijpen met betrekking tot de interactie tussen cellen of weefsels en het circulerende bloed.
Visualisatie van bloed vasculatuur in de hersenen en de hypofyse is belangrijk. Neuronen in de hersenen vereisen een hoge toevoer van zuurstof en glucose3, en de hypofyse bevat tot acht belangrijke hormoon-producerende cel typen die de bloedtoevoer gebruiken om het signaal van de hersenen te ontvangen en hun respectieve hormonen te sturen naar verschillende rand organen4,5. Terwijl in zoogdieren, de portal-systeem aan de basis van de hypothalamus de mediaan van de eminentie, verbindt de hersenen en de hypofyse6, zoals een duidelijke bloed brug is niet beschreven in Teleost vis. Inderdaad, in teleosts, preoptics-hypothalamic neuronen rechtstreeks project hun axonen in het pars nervosa van de hypofyse7 en meestal innervate de verschillende endocriene cel types direct8,9. Echter, sommige van deze neuronen hebben hun zenuwuiteinden gelegen in de extravascular ruimte, in de nabijheid van bloedvaten10. Daarom is het verschil tussen Teleost vissen en zoogdieren is niet zo duidelijk, en de relatie tussen het bloed vasculatuur en de hersenen en de hypofyse cellen vereist een groter onderzoek in Teleost vis.
Zebravis heeft, in vele aspecten, een anatomisch en functioneel vergelijkbaar vasculaire systeem aan andere gewervelde soorten11. Het is uitgegroeid tot een krachtig gewervelde model voor cardiovasculair onderzoek vooral dankzij de ontwikkeling van verschillende transgene lijnen waar componenten van het vasculaire systeem zijn gelabeld met TL-reporter eiwitten12. Nochtans, kan de nauwkeurige anatomie van de bloedsomloop tussen soorten, of zelfs tussen twee individuen variëren die tot de zelfde soort behoren. Daarom kan visualisatie van de bloedvaten van hoge rente ook in andere Teleost soorten waarvoor Transgenesis tools niet bestaan.
Verschillende technieken zijn beschreven om de bloedvaten label in zowel zoogdieren en teleosts. Deze omvatten in situ hybridisatie voor vasculatuur genen, alkalische fosfatase kleuring, microangiography, en Dye injecties (voor een herziening Zie13). Fluorescerende lipophilic kationische indocarbocyanine kleurstof (DiI) werd voor het eerst gebruikt om membraanlipiden laterale mobiliteit studie als het wordt bewaard in de lipide bilayers en kan migreren door middel van het14,15,16. Inderdaad, een molecuul van DiI is samengesteld uit twee koolwaterstof ketens en chromophores. Terwijl de koolwaterstofketens in het lipide bilayer celmembraan van de cellen in contact met het integreren, blijft chromophores op zijn oppervlakte17. Eenmaal in het membraan, DiI moleculen diffuse lateraal binnen de lipide bilayer die helpt bij de vlek membraan structuren die niet in direct contact met de DiI oplossing. Het injecteren van een DiI oplossing door middel van cardiale doorbloeding, zal daarom alle endothelial cellen in contact brengen met de verbinding waardoor directe etikettering van de bloedvat. Vandaag DiI wordt ook gebruikt voor andere kleuring doeleinden, zoals enkele molecule Imaging, Fate mapping, en neuronale tracing. Interessant, bestaan verscheidene fluorophores (met verschillende golflengten van emissie) toestaand de combinatie met andere fluorescente etiketten, en de integratie evenals de laterale verspreiding van DiI kan in zowel levende als vaste weefsels voorkomen18, 19.
Formaldehyde, ontdekt door Ferdinand Blum in 1893, is op grote schaal gebruikt om de huidige dag als de voorkeur chemische stof voor weefsel fixatie20,21. Het toont brede specificiteit voor de meeste cellulaire doelstellingen en bewaart cellulaire structuur22,23. Het bewaart ook de fluorescente eigenschappen van de meeste fluorophores, en kan zo worden gebruikt om transgene dieren te fixeren waarvoor de gerichte cellen fluorescente verslaggever proteïnen uitdrukken.
In dit manuscript is een vorig protocol ontwikkeld om de bloedvaten in kleine experimentele zoogdier modellen24 te labelen, aangepast aan het gebruik in vis. De hele procedure duurt slechts een paar uur uit te voeren. Het laat zien hoe perfuse een fixatief oplossing van formaldehyde met DiI in de vis hart om direct te labelen alle bloedvaten in de hersenen en de hypofyse van het model vis Medaka. Medaka is een klein zoet water vis inheems in Azië, voornamelijk gevonden in Japan. Het is een onderzoek modelorganisme met een reeks van moleculaire en genetische hulpmiddelen beschikbaar25. Daarom, de identificatie van de bloedvaten in deze soort, alsmede in andere zal toelaten om ons begrip te verbeteren over hoe de hersenen en de hypofyse cellen interageren met bloed vasculatuur in hele weefsel of dikke plakjes weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cardiale transfusie met DiI eerder is gebruikt om de bloedvaten label in verschillende modelsoorten24, met inbegrip van Teleost Fish13.
Aangezien DiI rechtstreeks wordt geleverd aan het endothelial celmembraan door middel van doorbloeding in de vasculatuur, is het mogelijk om de signaal-ruisverhouding te verhogen door de DiI concentratie in de fixatie oplossing te verhogen. Bovendien, de fluorophore biedt intense kleuring wanneer opgew…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Medaka Kanda voor de demonstratie van cardiale doorbloeding met fixatieve oplossing in, mevrouw Lourdes Carreon G Tan voor hulp bij Medaka veeteelt, en de heer Anthony Peltier voor illustraties. Dit werk werd gefinancierd door NMBU en door de Raad van het onderzoek van Noorwegen, toelage nummer 248828 (digitaal leven het programma van Noorwegen).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. . Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Biologie du développement. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochimie. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
