Étiquetage des vaisseaux sanguins dans le cerveau de Teleost et l’hypophyse utilisant la perfusion cardiaque avec un DiI-fixatif
Summary
L’article décrit un protocole rapide pour l’étiquetage des vaisseaux sanguins dans un poisson téléostéen par perfusion cardiaque de DiI dilué dans fixatif, en utilisant Medaka (Oryzias latipes) comme un modèle et en se concentrant sur le cerveau et le tissu hypophysaire.
Abstract
Les vaisseaux sanguins innervent tous les tissus des vertébrés, permettant leur survie en fournissant les nutriments nécessaires, l’oxygène, et les signaux hormonaux. Il est l’un des premiers organes à commencer à fonctionner pendant le développement. Les mécanismes de formation des vaisseaux sanguins sont devenus un sujet d’intérêt scientifique et clinique élevé. Chez les adultes, cependant, il est difficile de visualiser la système vasculaire chez la plupart des animaux vivants en raison de leur localisation profonde dans d’autres tissus. Néanmoins, la visualisation des vaisseaux sanguins reste importante pour plusieurs études telles que l’endocrinologie et la neurobiologie. Alors que plusieurs lignées transgéniques ont été développées dans le zébrafish, avec des vaisseaux sanguins directement visualisés par l’expression de protéines fluorescentes, aucun outil de ce type n’existe pour d’autres espèces de téléostéens. En utilisant Medaka (Oryzias latipes) comme modèle, le protocole actuel présente une technique rapide et directe pour étiqueter les vaisseaux sanguins dans le cerveau et l’hypophyse en perfusant à travers le coeur avec fixatif contenant dii. Ce protocole permet l’amélioration de notre compréhension sur la façon dont le cerveau et les cellules pituitaires interagissent avec le sang système vasculaire dans les tissus entiers ou des tranches de tissu épais.
Introduction
Les vaisseaux sanguins jouent un rôle essentiel dans le corps des vertébrés car ils fournissent les nutriments nécessaires, l’oxygène et les signaux hormonaux à tous les organes. En outre, depuis la découverte de leur implication dans le développement du cancer1, ils ont reçu beaucoup d’attention dans la recherche clinique. Bien qu’un certain nombre de publications ont étudié les mécanismes permettant la croissance des vaisseaux sanguins et la morphogenèse, et un grand nombre de gènes importants pour leur formation ont été identifiés2, beaucoup reste à comprendre en ce qui concerne l’interaction entre les cellules ou les tissus et le sang circulant.
Visualisation de système vasculaire sanguine dans le cerveau et l’hypophyse est important. Neurones dans le cerveau exigent un apport élevé d’oxygène et de glucose3, et l’hypophyse contient jusqu’à huit importants types de cellules productrices d’hormones qui utilisent le flux sanguin pour recevoir le signal du cerveau et envoyer leurs hormones respectives à différents organes périphériques4,5. Alors que chez les mammifères, le système de portail à la base de l’hypothalamus nommé l’éminence médiane, relie le cerveau et l’hypophyse6, un tel pont sanguin clair n’a pas été décrit dans les poissons téléostéens. En effet, dans les téléostéens, les neurones préoptico-hypothalamiques projetaient directement leurs axones dans la pars nerveuse de l’hypophyse7 et innervent principalement les différents types de cellules endocriniennes directement8,9. Cependant, certains de ces neurones ont leurs terminaisons nerveuses situées dans l’espace extravasculaire, à proximité des capillaires sanguins10. Par conséquent, la différence entre le poisson téléostéen et les mammifères n’est pas si claire, et la relation entre la vascularisation du sang et le cerveau et les cellules pituitaires nécessite une plus grande investigation dans les poissons téléostéens.
Le zébrafish a, dans de nombreux aspects, un système vasculaire anatomiquement et fonctionnellement comparable à d’autres espèces de vertébrés11. Il est devenu un modèle de vertébrés puissant pour la recherche cardiovasculaire principalement grâce au développement de plusieurs lignées transgéniques où les composants du système vasculaire sont étiquetés avec des protéines de reporter fluorescentes12. Cependant, l’anatomie exacte du système circulatoire peut varier entre les espèces, ou même entre deux individus appartenant à la même espèce. Par conséquent, la visualisation des vaisseaux sanguins peut être d’un intérêt élevé aussi chez d’autres espèces de téléostéens pour lesquelles les outils de transgenèse n’existent pas.
Plusieurs techniques ont été décrites pour étiqueter les vaisseaux sanguins chez les mammifères et les téléostéen. Ceux-ci comprennent l’hybridation in situ pour les gènes spécifiques à la vasculature, la coloration de la phosphatase alcaline, la microangiographie et les injections de colorant (pour un examen voir13). Fluorescent lipophilique cationique indocarbocyanine colorant (DII) a d’abord été utilisé pour étudier la mobilité latérale des lipides membranaires comme il est conservé dans les bicouches lipidiques et peut migrer à travers elle14,15,16. En effet, une molécule de DiI est composée de deux chaînes d’hydrocarbures et de chromophores. Alors que les chaînes d’hydrocarbures s’intègrent dans la membrane cellulaire bicouche lipidique des cellules en contact avec elle, les chromophores restent sur sa surface17. Une fois dans la membrane, les molécules de DiI diffusent latéralement dans la bicouche lipidique qui aide à tacher les structures membranaires qui ne sont pas en contact direct avec la solution DiI. Injecter une solution de DiI par perfusion cardiaque, va donc étiqueter toutes les cellules endothéliales en contact avec le composé permettant l’étiquetage direct des vaisseaux sanguins. Aujourd’hui, le DiI est également utilisé à d’autres fins de coloration, telles que l’imagerie à molécule unique, la cartographie du destin et le traçage neuronale. Fait intéressant, plusieurs fluorophores existent (avec différentes longueurs d’onde d’émission) permettant la combinaison avec d’autres étiquettes fluorescentes, et l’incorporation ainsi que la diffusion latérale de DiI peut se produire dans les tissus vivants et fixes18, le 19.
Le formaldéhyde, découvert par Ferdinand Blum en 1893, a été largement utilisé à l’heure actuelle comme le produit chimique préféré pour la fixation des tissus20,21. Il montre une grande spécificité pour la plupart des cibles cellulaires et préserve la structure cellulaire22,23. Il préserve également les propriétés fluorescentes de la plupart des fluorophores, et peut donc être utilisé pour fixer des animaux transgéniques pour lesquels des cellules ciblées expriment des protéines de reporter fluorescentes.
Dans ce manuscrit, un protocole antérieur développé pour étiqueter les vaisseaux sanguins dans les petits modèles expérimentaux de mammifères24 a été adapté à l’utilisation chez les poissons. L’intégralité de la procédure ne prend que quelques heures à effectuer. Il démontre comment perfuser une solution fixateur de formaldéhyde contenant DII dans le coeur de poisson afin d’étiqueter directement tous les vaisseaux sanguins dans le cerveau et l’hypophyse du modèle de poissons medaka. Medaka est un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie, qui se trouve principalement au Japon. C’est un organisme modèle de recherche avec une suite d’outils moléculaires et génétiques disponibles25. Par conséquent, l’identification des vaisseaux sanguins dans cette espèce ainsi que dans d’autres permettra d’améliorer notre compréhension sur la façon dont le cerveau et les cellules pituitaires interagissent avec système vasculaire sanguine dans les tissus entiers ou des tranches de tissu épais.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perfusion cardiaque avec le DiI a précédemment été utilisée pour étiqueter des vaisseaux sanguins dans plusieurs espèces modèles24, y compris les poissons téléostéens13.
Comme DII est directement livré à la membrane cellulaire endothéliale par perfusion dans le vasculature, il est possible d’augmenter le rapport signal-bruit en augmentant la concentration de DII dans la solution fixateur. En outre, le fluorophore fou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Shinji Kanda pour la démonstration de la perfusion cardiaque avec une solution fixateur dans medaka, Mme Lourdes Carreon G Tan pour l’aide à l’élevage medaka, et m. Anthony Peltier pour les illustrations. Ce travail a été financé par la NMBU et par le Conseil de recherche de la Norvège, Grant number 248828 (programme Digital Life Norvège).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
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