텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

Summary

이 기사에서는 픽스 쳐에 희석 한 DiI의 심장 관류에 의해 텔 레 ost 물고기의 혈관을 라벨링 하기 위한 빠른 프로토콜을 설명 하고, 송사리를 모델로 하 고 뇌 및 뇌 하 수 체 조직에 초점을 맞추고 있습니다.

Abstract

혈관은 척추 동물의 모든 조직을 자극 하 여 필요한 영양분, 산소 및 호르몬 신호를 제공 함으로써 생존을 가능 하 게 합니다. 그것은 개발 하는 동안 작동을 시작 하는 첫 번째 장기 중 하나입니다. 혈관 형성의 메커니즘은 높은 과학적 및 임상 관심의 대상이 되고있다. 그러나 성인의 경우 다른 조직 내에서 자신의 국 소화로 인해 대부분의 살아있는 동물에서 혈관 구조를 시각화 하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구 하 고, 혈관의 시각화는 내 인 성 및 신경 생물학과 같은 여러 연구에 중요 한 남아 있다. 몇몇 형질 전환 선은 제 브라 피쉬에서 개발 되었지만, 혈관이 형광 단백질의 발현을 통해 직접적으로 가시화 되는 반면, 다른 텔 레 ost 종에는 그러한 도구가 존재 하지 않습니다. 모델으로 서 송사리를 사용 하 여, 현재 프로토콜은 신속 하 고 직접적인 기술을 제공 하 여 뇌와 뇌 하 수 체에 혈관을 레이블 고정을 포함 하 여 심장 통해 사용 하 여. 이 프로토콜은 뇌와 뇌 하 수 체 세포가 전체 조직 또는 두꺼운 조직 조각에서 혈액 맥 관 구조와 상호 작용 하는 방법에 대 한 우리의 이해의 향상을 허용.

Introduction

그들은 모든 기관에 필요한 영양소, 산소와 호르몬 신호를 제공으로 혈관은 척추 동물 body의 필수적인 부분을 재생 합니다. 또한, 암 개발¹에 그들의 관여의 발견 이후, 그들은 임상 연구에 많은 관심을 받았다. 다 수의 간행물은 혈관 성장 및 형태 형성을 허용 하는 기전을 조사 하였으나, 그들의 생성을 위해 중요 한 다 수의 유전자가확인 되었지만, 많은 것은 상호 작용에 관하여 이해 될 수 있다 세포 또는 조직과 순환 혈액 사이.

뇌와 뇌 하 수 체에서 혈액 혈관의 시각화는 중요 하다. 두뇌에 있는 신경은 산소와 포도 당³의 높은 공급을 요구 하 고, 뇌에서 신호를 수신 하 고 다른 그들의 각각 호르몬을 보낼 혈 류를 사용 하 여 8 개의 중요 한 호르몬 생산 세포 유형을 포함 하는 뇌 하 수 체 주변 기관^4,5. 포유동물에 있는 동안, 시상 하 부의 기지에 있는 포털 시스템은 중앙값 미 넨 스 이라고 명명 하 고, 두뇌와 뇌 하 수 체⁶을 연결 합니다, 그런 명확한 혈액 교량은 teleost 물고기에서 기술 되지 않았습니다. 실제로, 텔 레 티코-시상 하 부 뉴런은 뇌 하 수 체⁷ 의 par nervosa에 직접 축 삭을 투사 하 고 주로 다른 내 분 비 세포 유형을 직접^8,9로 자극 합니다. 그러나, 이러한 뉴런의 일부는 extravascular 공간에 있는 그들의 신경 종말, 혈액 모세 혈관에 가까운 근처에¹⁰. 따라서, teleost 물고기와 포유류의 차이 그렇게 명확 하지 않습니다., 그리고 혈액 맥 관 구조와 두뇌와 뇌 하 수 체 세포 사이의 관계는 teleost 물고기에서 더 큰 조사를 필요로.

제 브라 피시는 다양 한 측면에서, 해부학 적이 고 기능적으로 필적 하는 혈관 시스템을 다른 척추 동물 종¹¹에 보유 하 고 있습니다. 그것은 심혈 관 시스템의 구성 요소 형광 리포터 단백질¹²로 표시 되는 여러 형질 전환 라인의 개발 덕분에 심장 혈관 연구에 대 한 강력한 척추 동물 모델이 되고있다. 그러나, 정확한 순환 시스템 해부학은 종 사이에서 다를 수 있습니다, 또는 심지어 같은 종에 속하는 두 개인 사이. 따라서, 혈관의 시각화는 변환 도구가 존재 하지 않는 다른 teleost 종에도 높은 관심을 가질 수 있다.

포유류와 전보 모두에서 혈관에 라벨을 지정 하는 몇 가지 기술이 설명 되어 있습니다. 이들은 맥 관 구조 특정 유전자를 위한 현장 잡종 화, 알칼리 성 인산 가수분해 물 염색, 미세 혈관 조 영 법 및 염료 주사를 포함 합니다 (검토를 위해¹³참조). 형광 성 친 유성 양이온 indocarbocyanine 염료 (DiI)는 지질 이중 층에서 유지 되 고 그것을^14,15,16을 통해 마이그레이션할 수 있으므로 막 지질 측면 이동성을 연구 하기 위해 처음 사용 되었다. 실제로 DiI의 분자는 두 개의 탄화수소 체인과 발 색 단이 구성 되어 있습니다. 탄화수소 사슬이 그것에 접촉 하는 세포의 지질 이중 층 세포 막에 통합 되는 동안, 발 색 단은 그 표면¹⁷에 남아 있습니다. 일단 막에, DiI 분자는 DiI 용액과 직접적으로 접촉 하지 않는 막 구조물을 오염 시키는 것을 돕는 지질 이중 층 내에서 횡 방향으로 확산 됩니다. 심장 관류를 통해 DiI 용액을 주입 하는 것은, 따라서 혈관의 직접적인 라벨링을 허용 하는 화합물과 접촉 하는 모든 내 피 세포를 라벨링 할 것 이다. 오늘날 DiI는 또한 단일 분자 이미징, 운명 매핑, 뉴런 추적과 같은 다른 염색 목적으로 사용 됩니다. 흥미롭게도, 다른 형광 레이블과의 조합을 허용 하는 몇몇 형광 물질 (방출의 다른 파장)이 존재 하 고, DiI의 측면 확산 뿐만 아니라 결합이 살아있는 및 고정 조직 모두에서 발생할 수 있다^{18, 19}.

포름알데히드는 1893에서 페르디난드 블 룸에 의해 발견 되었으며, 조직 고정^20,21에 대 한 바람직한 화학 물질로 서 현재까지 널리 사용 되 고 있다. 이는 대부분의 세포 표적에 대 한 광범위 한 특이성을 나타내고 세포 구조^22,23을 보존 한다. 그것은 또한 대부분의 형광 발 색의 형광체를 보존 하며, 따라서 표적 세포가 형광 리포터 단백질을 발현 하는 형질 전환 동물을 고정 시키기 위해 사용 될 수 있다.

이 원고에서, 작은 실험 포유류 모델 (²⁴ )에서 혈관에 라벨을 지정 하기 위해 개발 된 이전 프로토콜은 어류에서의 사용에 적응 되었다. 전체 절차는 수행 하는 데 몇 시간 밖에 걸리지 않습니다. 그것은 직접 뇌의 모든 혈관과 모델 물고기 medaka의 뇌 하 수 체에 레이블을 하기 위해 물고기 심장에 DiI를 포함 하는 포름알데히드의 고정 솔루션을 사용 하는 방법을 보여줍니다. Medaka는 주로 일본에서 발견 되는 아시아에서 자생 하는 작은 민물 어류입니다. 그것은 분자 및 유전 도구의 제품군을 사용할 수 있는 연구 모델 유기 체입니다²⁵. 따라서,이 종에서 뿐만 아니라 다른 사람에서 혈관의 식별 뇌와 뇌 하 수 체 세포가 전체 조직 또는 두꺼운 조직 조각에 혈액 맥 관 구조와 상호 작용 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 개선 하는 것을 허용 합니다.

Protocol

모든 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학교에서 연구 동물의 보살 핌과 복지에 대 한 권고에 따라 수행 되었으며, 권한 있는 구도 자의 감독 하에 실시 되었습니다. 1. 장비 및 솔루션의 준비 1.5 mL 플라스틱 튜브에 96%에 토를 사용 하 여 dii 5 mg을 용 해 하는 DiI 스톡 용액 준비 30 초에 대 한 소용돌이 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 덮여 유지 합니다.참고:</stro…

Representative Results

이 프로토콜은 송사리 뇌와 뇌 하 수 체에서 혈관에 레이블을 지정 하는 단계 절차를 보여 주며 동시에 조직을 수정 합니다. DiI를 포함 하는 고착 성 용액을 심장에 심장 주입 하 여 라벨링 한 후, 형광 실체 현미경을 사용 하는 슬라이스 (그림 4) 또는 전체 조직에 대 한 혈관을 관찰할 수 있습니다 (그림 5). 두꺼운 조직 슬라이스 또는 전체 조직에, 혈액 …

Discussion

이전에 DiI를 가진 심장 관류는 teleost 물고기¹³을 포함 하 여 몇몇 모형 종²⁴에 있는 혈관에 상표를 지정 하기 위하여 이용 되었습니다_.

DiI는 혈관 구조에서 관류에 의해 내 피 세포 막으로 직접 전달 되기 때문에, 고정 용액에서 DiI 농도를 증가 시 킴으로써 신호 대 잡음비를 증가 시킬 수 있다. 또한, 형광 단을 최소한의 표백으로 흥?…

Materials

16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15711
5 mL Syringe PP/PE without needle	Sigma	Z116866-100EA	syringes
BD Precisionglide syringe needles	Sigma	Z118044-100EA	needles 18G (1.20*40)
borosilicate glass 10cm OD1.2mm	sutter instrument	BF120-94-10	glass pipette
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D-282
LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm	Portex	800/110/340/100	canula
Phosphate Buffer Saline (PBS) solution	Sigma	D8537-6X500ML
pipette puller	Narishige	PC-10
plastic petri dishes	VWR	391-0442
Super glue gel	loctite	c4356
tricaine (ms-222)	sigma	E10521-50G