Маркировка кровеносных сосудов в телемост мозга и гипофиза использованием сердечной перфузии с DiI-фиксативный
Summary
В статье описывается быстрый протокол для маркировки кровеносных сосудов в телеост рыбы сердечной перфузии DiI разбавленной в фиксаторе, используя medaka (Oryzias latipes) в качестве модели и упором на мозг и гипофиз ткани.
Abstract
Кровеносные сосуды иннервируют все ткани у позвоночных, позволяя их выживание, обеспечивая необходимые питательные вещества, кислород и гормональные сигналы. Это один из первых органов, чтобы начать функционировать во время развития. Механизмы формирования кровеносных сосудов стали предметом высокого научного и клинического интереса. У взрослых, однако, трудно визуализировать сосуды в большинстве живых животных из-за их локализации глубоко в других тканях. Тем не менее, визуализация кровеносных сосудов остается важным для нескольких исследований, таких как эндокринология и нейробиология. В то время как несколько трансгенных линий были разработаны в зебрафиш, с кровеносными сосудами непосредственно визуализированы через экспрессию флуоресцентных белков, нет таких инструментов существуют для других видов телеост. Использование medaka (Oryzias latipes) в качестве модели, текущий протокол представляет собой быструю и прямую технику для обозначения кровеносных сосудов в мозге и гипофиза, наполнив через сердце с фиксатором, содержащим DiI. Этот протокол позволяет улучшить наше понимание того, как мозг и гипофиз клетки взаимодействуют с сосудами крови в цельной ткани или толстые ломтики ткани.
Introduction
Кровеносные сосуды играют важную часть тела позвоночных, поскольку они обеспечивают необходимые питательные вещества, кислород и гормональные сигналы для всех органов. Кроме того, с момента открытия их участия в развитии рака1, они получили большое внимание в клинических исследованиях. Хотя ряд публикаций исследовали механизмы, позволяющие рост кровеносных сосудов и морфогенез, и большое количество генов, важных для их формирования были определены2, многое еще предстоит понять в отношении взаимодействия между клетками или тканями и циркулирующей кровью.
Визуализация сосудов крови в головном мозге и гипофиза имеет важное значение. Нейроны в головном мозге требуют высокой поставки кислорода и глюкозы3, и гипофиза содержит до восьми важных гормонов-производящих типов клеток, которые используют кровоток, чтобы получать сигнал от мозга и отправить свои гормоны в различные периферийные органы4,5. В то время как у млекопитающих, порталная система в основании гипоталамуса имени среднего выдающего, связывает мозг и гипофиз6, такой ясный мост крови не был описан в телеост рыбы. Действительно, в teleosts, преоптико-гипоталамические нейроны непосредственно проект их аксоны в парс нервной гипофиза7 и в основном innervate различных типов эндокринных клеток непосредственно8,9. Тем не менее, некоторые из этих нейронов имеют свои нервные окончания, расположенные во внесосудистом пространстве, в непосредственной близости от капилляров крови10. Таким образом, разница между телеост рыбы и млекопитающих не так ясно, и связь между сосудами крови и мозга и гипофиза клетки требует большего изучения в телеост рыбы.
Зебрафиш имеет, во многих аспектах, анатомически и функционально сопоставимы сосудистой системы с другими видами позвоночных11. Он стал мощной моделью позвоночных для сердечно-сосудистых исследований в основном благодаря развитию нескольких трансгенных линий, где компоненты сосудистой системы помечены флуоресцентными белками репортера12. Тем не менее, точная анатомия системы кровообращения может варьироваться между видами, или даже между двумя лицами, принадлежащими к тому же виду. Таким образом, визуализация кровеносных сосудов может представлять большой интерес и в других видах телеост, для которых трансгенез инструменты не существуют.
Несколько методов были описаны для обозначения кровеносных сосудов у млекопитающих и телеост. К ним относятся на месте гибридизации для сосуд-специфических генов, щелочной фосфатазы окрашивания, микроангиографии, и красителя инъекции (для обзора см.13). Флуоресцентные липофильные катионные инокарбоциановые красители (DiI) был впервые использован для изучения боковых подвижности мембранных липидов, поскольку он сохраняется в липидных двуслойных и может мигрировать через него14,15,16. Действительно, молекула DiI состоит из двух углеводородных цепей и хромофоров. В то время как углеводородные цепи интегрируются в липидную двухслойную клеточную мембрану клеток клеток, соприкасающихся с ним, хромофоры остаются на его поверхности17. Оказавшись в мембране, молекулы DiI рассеиваются боково внутри липидного двухслойного, который помогает запятнать мембранные структуры, которые не находятся в непосредственном контакте с раствором DiI. Инъекция раствора DiI через перфузию сердца, поэтому пометить все эндотелиальные клетки в контакте с соединением, позволяющим прямой маркировки кровеносных сосудов. Сегодня DiI также используется для других целей окрашивания, таких как одномолекулярная визуализация, картирование судьбы и отслеживание нейронов. Интересно, что существует несколько флюорофоров (с различными длинами волн эмиссии), что позволяет сочетание с другими флуоресцентными этикетками, и включение, а также боковое распространение DiI может произойти как в живых, так и в фиксированных тканях18, 19.
Формальдегид, обнаруженный Фердинандом Блюмом в 1893 году, широко используется по сей день в качестве предпочтительного химического вещества для фиксации тканей20,21. Он показывает широкую специфику для большинства клеточных целей и сохраняет клеточную структуру22,23. Он также сохраняет флуоресцентные свойства большинства флуорофоров, и, таким образом, может быть использован для фиксации трансгенных животных, для которых целевые клетки выражают флуоресцентные белки репортера.
В этой рукописи предыдущий протокол, разработанный для обозначения кровеносных сосудов в небольших экспериментальных моделях млекопитающих24, был адаптирован к использованию в рыбе. Вся процедура занимает всего пару часов. Он демонстрирует, как пронизать фиксаторный раствор формальдегида, содержащего DiI в сердце рыбы для того, чтобы непосредственно пометить все кровеносные сосуды в головном мозге и гипофиза модели рыбы medaka. Медака – маленькая пресноводная рыба, произрастая в Азии, в основном в Японии. Это исследовательская модель организма с набором молекулярно-генетических инструментов, доступных25. Таким образом, идентификация кровеносных сосудов у этого вида, а также в других позволит улучшить наше понимание того, как мозг и гипофиз клетки взаимодействуют с сосудами крови в цельной ткани или толстые ломтики ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сердечная перфузия с DiI ранее была использована для обозначения кровеносных сосудов в нескольких модельных видов24,в том числе телеост рыбы13.
Поскольку DiI непосредственно доставляется в эндотелиальную клеточную мембрану путем перфузии в ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Синдзи Канду за демонстрацию перфузии сердца с фиксаторным решением в Медаке, г-жу Лурдес Карреон Г Тан за помощь в медаке и г-на Энтони Пелтиера за иллюстрации. Эта работа была профинансирована НМБУ и Научно-исследовательским советом Норвегии, грант омовая программа 248828 (программа Digital Life Norway).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. . Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Biologie du développement. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochimie. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
