Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme
Summary
Bu makalede, bir teleost balık kan damarlarında etiketleme için hızlı bir protokol açıklar dıı kalp perfüzyon tarafından fiktatif olarak seyreltilebilir, Medaka kullanarak (Oryzias latipes) bir model olarak ve beyin ve hipofiz doku odaklanmak.
Abstract
Kan damarlarında omurgada tüm dokularda inler, gerekli besin sağlayarak onların hayatta kalma sağlayan, oksijen, ve hormonal sinyaller. Kalkınma sırasında işleyişi başlatmak için ilk organlardan biridir. Kan damar oluşumu mekanizmaları yüksek bilimsel ve klinik ilgi konusu haline gelmiştir. Ancak yetişkinlerde, diğer dokularda lokalizasyonu nedeniyle en canlı hayvanlarda damarlarını görselleştirmek zordur. Bununla birlikte, kan damarlarının görselleştirme Endokrinoloji ve Nörobiyoloji gibi çeşitli çalışmalar için önemli kalır. Çeşitli transjenik çizgiler zebrafish geliştirilmiştir iken, doğrudan floresan proteinleri ifadesi ile görüntülenen kan damarları ile, bu tür araçlar diğer teleost türleri için mevcut. Kullanarak Medaka (Oryzias latipes) bir model olarak, mevcut protokol, beyin ve hipofiz kan damarları etiket ile fiksatif ile kalp aracılığıyla durumu ile hızlı ve doğrudan bir teknik sunar dıı. Bu protokol, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızın iyileştirilmesi sağlar.
Introduction
Tüm organlar için gerekli besin, oksijen ve hormonal sinyaller sağlamak gibi kan damarlarının omurga vücudun önemli bir parçası oynamak. Ayrıca, kanser gelişimi1, onların katılımı keşif beri, onlar klinik araştırmalarda çok dikkat aldılar. Her ne kadar yayınlar bir dizi kan damarının büyümesi ve morfojenine izin veren mekanizmaları araştırmış olsa da, oluşumları için önemli olan çok sayıda gen tespit edilmiştir2, bir lot etkileşimi ile ilgili anlaşılabilir kalır hücreler, dokular ve dolaşım kanı arasında.
Beyin ve hipofiz kan damar görselleştirme önemlidir. Beynin nöronlar oksijen ve glukoz3yüksek bir tedarik gerektirir ve hipofiz beyinden sinyal almak ve farklı kendi hormonları göndermek için kan akışını kullanan sekiz önemli hormon üreten hücre tipleri içerir Periferik organlar4,5. Memelilerde ise, hipotalamus tabanında Portal sistemi Median Kardinal adlı, beyin ve hipofiz6bağlar, böyle bir açık kan Köprüsü teleost balık tarif edilmedi. Gerçekten de, teleosts, preoptico-hipotalamik nöronlar doğrudan hipofiz pars nervoza içine akons proje7 ve çoğunlukla farklı endokrin hücre türleri doğrudan invate8,9. Ancak, bazı bu nöronların sinir uçları ekstrasküler uzayda bulunan, kan kapillaries yakın çevresinde10. Bu nedenle, teleost balık ve memeliler arasındaki fark o kadar açık değildir, ve kan damar ve beyin ve hipofiz hücreleri arasındaki ilişki teleost balık daha fazla soruşturma gerektirir.
Zebrafish, birçok yönden, anatomik ve fonksiyonel olarak karşılaştırılabilir damar sistemi diğer omurgacı türler11vardır. Vasküler sistemin bileşenlerinin floresan muhabir proteinleri12ile etiketlendiği çeşitli transjenik hatların geliştirilmesi sayesinde kardiyovasküler araştırmalar için güçlü bir omurga modeli haline gelmiştir. Ancak, tam dolaşım sistemi anatomisi türler arasında, hatta aynı türe ait iki kişi arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, kan damarlarının görselleştirme nakliyle araçları mevcut olmayan diğer teleost türler de yüksek ilgi olabilir.
Çeşitli teknikler hem memeliler ve teleosts kan damarlarında etiket açıklanmıştır. Bu, damar spesifik genler için situ hibridizasyon dahil, alkalin fosfataz boyama, mikroanjiyografi, ve boya enjeksiyonları (bir inceleme için bakınız13). Floresan lipophilik katyonik indocarbocyanine boya (diI) ilk olarak lipid bilayers korunur ve bunu üzerinden göç edebilir membran lipidler lateral hareketlilik çalışması için kullanılan14,15,16. Nitekim, dıı bir molekül iki hidrokarbon zincirleri ve chromophores oluşur. Hidrokarbon zincirleri ile temas hücrelerinde lipid fosfolipid hücre membranı entegre iken, chromophores yüzeyinde kalır17. Membranda, dıı molekülleri, DLI çözeltisi ile doğrudan temas etmeyen membran yapılarını lekeleymenize yardımcı olan lipid fosfolipid içinde lateral olarak diffdür. Kardiyak perfüzyon yoluyla bir dıı çözeltisi enjekte, bu nedenle kan damarlarının doğrudan etiketleme sağlayan bileşik ile temas tüm endotel hücreleri etiketleyecektir. Bugün dıı aynı zamanda tek molekül görüntüleme, kader haritalama ve nöronal izleme gibi diğer boyama amaçları için kullanılır. İlginçtir, çeşitli fluorophores var (emisyon farklı dalga boyları ile) Diğer Floresan etiketleri ile kombinasyon sağlayan, ve birleşme yanı sıra dıı lateral difüzyon hem canlı ve sabit dokularda oluşabilir18, 19 yaşında.
1893 yılında Ferdinand Blum tarafından keşfedilen formaldehit, doku fikyasyonu için tercih edilen kimyasal olarak günümüze kadar yaygın olarak kullanılmıştır20,21. Çoğu hücresel hedefler için geniş spesifisite gösterir ve hücresel yapısı22,23korur. Aynı zamanda en fluorophores floresan özelliklerini korur, ve böylece hedeflenen hücreler floresan muhabir proteinleri ifade etmek için transgenik hayvanları sabitmek için kullanılabilir.
Bu yazıda, küçük deneysel memelilerde24 kan damarları etiketlemek için geliştirilen bir önceki protokol balık kullanımına adapte edilmiştir. Tüm prosedür gerçekleştirmek için sadece birkaç saat sürer. Doğrudan beyin ve model balık Medaka hipofiz tüm kan damarlarını etiketlemek için balık kalbi dıı içeren formaldehit bir fixatif çözeltisi serpmek gösterilmiştir. Medaka Asya ‘ya özgü küçük bir tatlı su balığı, öncelikle Japonya ‘da bulundu. Bu bir araştırma modeli organizma ve moleküler ve genetik Araçlar25kullanılabilir bir paketi ile. Bu nedenle, bu türün yanı sıra diğerlerinin yanı sıra kan damarlarının tanımlanması, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızı iyileştirmeye izin verecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dıı ile kardiyak perfüzyon daha önce birkaç model türleri kan damarlarını etiket için kullanılan24, teleost balık dahil13.
Dıı doğrudan endotel hücre membranına damar içindeki perfüzyon ile teslim edildiği gibi, fixatif çözelti içinde dıı konsantrasyonu artırarak sinyal-gürültü oranını artırmak mümkündür. Buna ek olarak, fluorophore nispeten uzun ömürlü emisyon sağlayan minimal beyazlatma ile heyec…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Shinji kanda ‘ya Medaka ‘da fikratif solüsyon, Bayan Lourdes Carreon G tan ve illüstrasyonlar için Bay Anthony Peltier ile kalp perfüzyon gösterimi için teşekkür ederiz. Bu çalışma NMBU ve Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi, Grant numarası 248828 (Digital Life Norveç programı).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. . Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Biologie du développement. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochimie. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
