정자는 성공적으로 난 모 세포를 비료를 통해 이동 해야 합니다. 여기에서, 우리는 C에서 정자 이동 측정에 대 한 분석을 설명 합니다 . 이 분석은 결합 후 자 궁 내 정자 분포에 대 한 정량적 데이터 뿐만 아니라 속도, 방향 속도 및 반전 주파수를 제공 할 수 있습니다.
성공적인 수정은 성적인 재생산에 근본적인, 아직 거의 여성 생식 기관 내의 난 모 세포에 정액을 안내 하는 기계 장치에 관하여 알려집니다. 체 외 연구에서 내부적으로 비 옥 동물의 정자는 그들의 주변에서 다양 한 단서에 응답할 수 있습니다 제안 하는 동안, 여성 생식 기관 내부 그들의 행동을 시각화 하는 무 능력 정자 마이그레이션 이해에 대 한 도전을 만듭니다. 및 이동성을 기본 환경에서 제공 합니다. 여기서는이 한계를 극복 하 고 투명 한 표 피를 활용 하는 c. 엘 더 스를 사용 하는 방법을 설명 합니다. C. 미토 콘 드리 아 염료로 염색 한 남성은 변성 여성 역할을 하는 성인 암수와 결합 되며, 형광으로 표시 된 정자를 남녀 양성 자 궁으로 침전 시킵니다. 표시 된 정자의 이주와 운동 성을 라이브 암수에서에 피 형광 현미경을 사용 하 여 직접 추적할 수 있습니다. 야생 형 동물에서는, 표지 된 정자의 약 90%가 자 궁을 통해 크롤링 하 고 수정 사이트, 또는 spermatheca에 도달 합니다. 자 궁의 심상은 자 궁 내의 정자의 배급 및 spermatheca에 도달 한 정액의 백분율을 평가 하기 위하여 짝짓기 후에 1 시간을 취할 수 있습니다. 대안적으로, 타임 랩 스 이미지는 정자 속도, 방향 속도 및 역전 주파수를 평가 하기 위해 짝짓기 직후에 촬영 될 수 있다. 이 방법은 여성 생식 관 내의 정자 지도와 운동 성을 조절 하는 데 중요 한 새로운 유전 및 분자 메커니즘을 식별 하는 c. 엘 레 강 스에 사용할 수 있는 다른 유전 및 분자 도구와 결합 될 수 있다.
정자 (정자가 라고도 함)가 난 모 세포를 향한 여성 생식 기관을 통해 이동 하는 분자 메커니즘은 잘 이해 되지 않지만 성적 생식에 기본입니다. 정자의 운동 성이 매우 역동적 이며 정자 속도와 방향성 운동 성을 변경 하는 강력한 통신 신호에 달려 있습니다.1,2,3,5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. c. 엘 레 강 스는 남녀 양성의 투명 한 표 피는 단일 세포 해상도2,3에서 살아있는 정자의 추적을 허용 하기 때문에 생체 내 정자의 움직임을 연구 하기 위한 강력한 모델이 되고있다 8,10. 이 백서의 목적은 C. 엘 더 스 틴 태 자 궁 내에서 정자의 움직임을 평가 하는 방법을 제공 하는 것입니다.
정자와 난 모 세포가 외부 환경에서 만나는 동물 종 (즉, 액 틱 환경)에서 정자는 난 모 세포가 분 비 하는 화학 전술 신호에 반응 합니다. 이 신호는 정자 운동의 방향을 안내 하 여 신호 소스4,6,11에 더 가깝게 합니다. 그러나, 훨씬 덜 내부적으로 비료 종에서 정자 운동에 대 한 알려져 있다. 주요 도전은 대부분의 종에 있는 현미경 검사 법에 접근 할 수 없는 여성 생식 기관의 건축입니다. 인간에서 시험관 내 연구, 생쥐, 돼지, 예를 들어 정자의 하위 인구가 chemoattractants, 유체 흐름 및 열 그라데이션1,5,9에 대응할 수 있다는 증거를 제공 하 고, 12. 이러한 시스템을 통해, 생체 내 정자의 움직임을 시각화 하 고 추적 하는 무 능력은 이러한 기능을 규제 하는 핵심 메커니즘을 발견 하기 위한 전략에 심각한 제한을 두고 있습니다.
이러한 한계를 극복 하기 위해, 우리는 인공 수정 후 정자를 직접 시각화 하 고, 생체 내 개별 정자 이동 매개 변수를 측정 하 고, 대상에 정자 인구의 능력을 측정 하기 위해 선 충 c. 엘 레 강 스를 사용 하는 방법을 개발 했습니다 . 시비 사이트. 이러한 방법, 함께 c. 엘 더 스 분자 및 유전 도구 세트, 정자 운동 성 행동을 조절 하는 화학 신호 분자와 분자 기계의 발견을 촉진. 예를 들어, 유전 스크린은 생체 내에서 효율적인 정자 운동에 필수적인 유전자를 식별 하기 위해 양성 또는 남성에서 실시 될 수 있다13. 분자는 정자 활성화, 이동 속도 및 방향 운동 성3에 대 한 효과를 테스트 하기 위해 양성 태 고 광고에 주입 될 수 있다. 추가적으로, 설명 된 방법은 자 궁 외 신체 위치로 악성 정자 이동을 모니터링 하 고 정자 경쟁을 평가 하기 위해 사용 될 수 있다10,14.
C. 자연에는 남녀 양성 및 남성으로 존재 합니다 ( 그림 1참조). 암수 태 고 드에는 두 개의 U 자형 팔이 있어 서로 거울로 된 이미지입니다. L4 애벌레 단계 동안, 가장 근 위부 배아 세포 (즉, spermatheca 근처의 세포)는 정자를 겪습니다. 각각의 1 차적인 정액은 감수 분열를 입력 하 고 4 개의 합 골 spermatocyte를 일으킵니다. 이 spermatids는 첫 번째 성숙한 난 모 세포와 함께 spermatids로 밀고 spermiogenesis15를 받아야 합니다. 성인 암수는 정자 생성에서 기원으로 전환 합니다. 난 모 세포는 gonad를 따라 조립 라인에서 성숙 하 고, gonad의 근 위 끝에 가장 성숙한 난 모 세포, spermatheca 옆에 있습니다. 정자의 MSP 신호는 meiotic 성숙과 배 란16,17을 유발 하는 데 필요 합니다. 남성 c.엘 레 강 스, 반면에, 정자만 생산 하는 J 자형 gonad. 정자는 정액 소포에 저장 됩니다. 암수와 결합 하면, 남성은 꼬리 근처에 있는 스파이 시를 외 음부로 삽입 합니다. Spermatids는 정액 유체18과 접촉할 때 사정 중에 활성화 됩니다. C. 엘 레 강 스 정자는 휘 발 되지 않으므로 수영 하지 않습니다. 대신, 그들은 생식 기관을 통해 기어, 운동에 대 한 의사 포드를 사용 하 여. 그것은 잘 확립 된 남성 정자,이는 더 큰 크기, 남녀 추 니 정자에 비해 경쟁 우위를가지고14.
이 방법에서, 남성 c. 엘 레 강 스는 정자 기증자 역할을 하 고 성인 hermaprhodites에 결합 된다. 성인 남성은 형광 성 미토 콘 드리 아 염료로 염색 되어 생성 된 정자를 생산 합니다. 한 번 남녀 양성의 외 음부를 통해 증 착 되 면 정자는 자 궁의 배아 주위를 spermatheca 또는 시비 사이트를 향해 기어 해야 합니다. C. 엘 더 스 모델의 투명 한 표 피는 여성 생식 기관을 통해 탐색 하는 각 개별 정자의 직접적인 시각화를 허용 합니다. 최근 몇 년 동안, 저희 연구실은이 방법을 사용 하 여 외 음부에서 정자를 인도 하는 F-시리즈 프로 스타 글란 딘의 클래스의 중요성을 입증 했습니다. 정자에의 한 양성 및 반응에의 한 합성을 관장 하는 분자 기계 심은 여전히 조사 중에 있습니다. 그러나, 정자 운동 성 및 이주를 평가 하기 위한이 방법은 크게 내부적 시비 동물에서 정자 및 난 모 세포 통신을 제어 하는 주요 선수의 식별을 용이 하 게 한다. 다음 프로토콜은이 분석을 수행 하는 방법을 단계별로 설명 합니다.
복잡 한 여성 생식 기관을 탐색 하 고 난 모 세포를 찾는 정자의 능력은 성적 재생에 중요 합니다. 내부적으로 시비 된 동물의 정자를 사용 하는 최근의 연구에 따르면 화학 신호, 유체 흐름 및 온도 기울기를 포함 한 다양 한환경 큐에 능동적으로 대응 하는 것이 좋습니다. 9 , 12. 그러나, 이러한 관측은 크게 시험관 실험에서 결과 거의 정자 행동 및 생식 기관 내에서 통신에 대 한 알려져 있다. 정자 이동 및 운동 성에 생체 내 데이터를 획득 하는 주요 장벽 중 하나는 대부분의 여성 생식 책자 내에서 가시성의 부족. 여기에서 설명 하는 방법은 c. 엘 더 스를 사용 하 여이 제한을 극복 합니다. 대표 결과 입증으로, 투명 표 피는 직접 시각화 및 살아있는, 온전한 유기 체에서 단일 세포 해상도에서 각 정자의 추적을 허용 한다.
C. 엘 더는 두 남녀가 있다. 남성은 XO 유전자 형으로 정자를 생산 하 고이 방법에서는 정자 기증자로 사용 됩니다. XX 유전자 형이 있는 암수는 개 질 된 여성입니다. 그들의 생식 기는 첫 번째 애벌레 단계에서 정자 생성을 받아야 하 고 성년에서 기원에 전환25. 이 분석은 생식 조직이 여성 생식 기관을 위한 모형을 제공 하는 성인 암수를 사용 합니다. 이 분석에서 두 남녀의 활용은 우리가 정자의 지도와 운동 성을 조절 할 수 있는 남성과 여성 모두에서 유전 및 분자 경로를 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 정자 이동 및 운동 성 뿐만 아니라 정자 및 난 모 세포 통신에 대 한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있습니다 c.엘 더 스에 대 한 사용할 수 있는 유전 및 분자 기술의 전체 호스트와 결합.
이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 섹션에 제공 된 세부 사항 외에 추가로 고려해 야 합니다.
웜
안개-q71( e1490)또는 그-8 (E1489) 돌연변이 남성은 N2 남성 대신에 사용 될 수 있다. 이러한 돌연변이는 문화권에서 남성의 빈도를 증가, 하지만 남성 짝짓기 또는 정자 기능에 영향을 주지 않습니다13. Q71) 암컷과 같은 여성은 양성 대신에 사용 될 수 있다. 그러나, 여성은 적절 한 난 모 세포의 개발을 허용 하기 위해 남성과 사전에 결합 해야 합니다. 이 사전 결합에서 수정 된 배아의 존재는 자 궁이 정자 분포를 제대로 평가할 수 있을 정도로 길다는 것을 보장 합니다. 돌연변이 또는 실험적 양성이 평가 되는 경우에는 대조 군 (들)을 포함 한다. 예를 들어, 돌연변이 형 암수는 분석에서 다른 변수들에 대 한 대조 군으로 서 wildtype N2 암수와 짝을 이루어야 합니다. RNA 간섭 분석을 위한 플라스 미드를 포함 하는 박테리아에 공급 된 양성은 또한 빈 벡터 조절을 포함 하는 박테리아로 공급 되어야 합니다. 정자가 수정 되는 외 음부 로부터의 거리는 정자, 수정 부위는 자 궁의 계란 수 (즉, 자 궁이 증가 하는 계란 수로 확장 됨)에 따라 다를 수 있습니다. 유전자 형 간의 비교가 이루어지는 경우, 그에 게 유사한 계란 수를 포함 하는 양성을 선택 합니다. 부 화 배아를 포함 하는 양성 또는 유 충을 선택 하지 마십시오. 남녀 양성을 해야 하는 최적의 연령을 확인 하기 위해 시간 과정이 수행 될 수 있습니다.
남녀 양성 및 남성 따기
이 분석을 위해 고른 암수는 자란 또는 굶 어 지는 판에서가 아니라는 것이 중요 합니다. 음식 및 페로몬 단서는 TGFß 상 동체의 DAF-7의 발현을 조절 한다. DAF-7 통로는 spermatheca20으로 정자를 인도 하는 데 중요 한 역할을 하는 F-시리즈 프로 스타 글란 딘의 합성을 조절 하는 것으로 나타났습니다. 혼잡 하거나 굶는 접시에서 암수를 따기 가난한 정자 지도 관심의 대상에 관련 되지 발생할 수 있습니다. 판의 밀도는 남성 정자에 영향을 미치지 않는 것 같습니다. 그러나 너무 젊은 또는 너무 오래 된 남성은 결합 효율을 감소 시킬 수 있습니다 (즉, 결합 플레이트에 양성의 퍼센트는 그들의 자궁내에 있는 충분 한 정자를 정량화 하는). 1-3 하루 오래 된 성인 남성은이 분석에 대 한 최적의23.
마 취 암수
테 트 라 미 솔과 트리 네이 저의 조합은 벌레가 움직이지 않도록 하 고, 짝짓기와 이미지 수집 중에도 살아 남습니다. 나트륨 아 지 드 같은 다른 마 취 제도 사용 될 수 있다. 그러나 나트륨 아 지 드은 독성이 높고 조건을 표준화 해야 합니다. 마이크로 비드, 아가 로스 및 미세 유체 챔버를 사용 하는 고정 기법은 결합을 방해 하므로 권장 되지 않습니다.
남성 염색
이 원고, MitoTrackerCMXRos에 사용 된 미토 염료는 c.엘 레 강 스에서 정자 뿐만 아니라 다른 미토 콘 드리 아를 라벨링 하는 데 널리 사용 되어 왔습니다. 이 미토 염료로 표지 된 정자는 완전히 기능적 이어서 활성화 되 고, 이동 하 고, 난 모 세포를 비 옥 하 고, 생존 가능한 자손26,27을 생산 하는 능력을 유지 합니다. 로 다 민 6g 및 DiOC6와 같은 다른 미토 콘 드리 아 염료는 c. 엘 더 스 미토 콘 드리 아28,29를 얼룩에 사용 되었습니다. 그러나,이 염료에 대 한 조건은이 분석에서 정액 라벨링을 위해 표준화 될 필요가 있습니다. Mitochrondrial 라벨링 메커니즘 외에도, Syto17와 같은 DNA 얼룩은 또한 마이그레이션 분석 법30에 대 한 정자 라벨에 사용 될 수 있다. 이러한 라벨링 기술은 비교적 쉽고 빠르게 수행 되는 반면, 트랜스 제 닉 전략은 또한 정자 별 프로모터 (31),32에 따라 형광 태그를 발현 하는 정자를 생성 하기 위해 채택 될 수 있다.
짝짓기
너무 두 껍 지 않은 결합 점은 결합 효율을 저하 시킬 수 있습니다. 치료는 남성을 전송 하는 경우 가능한 한 작은 박테리아로 전송 하 고 짝짓기 점 상 암수를 마 취 해야한다.
아가 로스 패드 만들기 및 커버 슬립 배치
에 어 버블은 아가 로스 패드에서 생성 될 수 있습니다. 이미지를 획득 하는 동안 빛을 굴절 시키거나, 충분히 큰 경우 웜이 통과 하 여 이미지를 획득할 수 없게 됩니다. 마찬가지로, 공기 방울은 아가 로스 패드에 커버 슬립이 배치 될 때 암수를 따라 생성 될 수 있습니다. 이러한 버블은 빛을 굴절 시켜 이미지 품질을 저하 시킵니다. 연습은 기포의 발생을 감소 도움이 될 것입니다.
정량화
정자 배급을 정량화 할 때, 웜의 자 궁을 통해 다른 z 평면은 정자 분포에 약간의 차이가 있을 수 있습니다. 우리는 spermatheca에 초점을 맞춘 단일 이미지를 복용 우리에 게 여러 z 섹션을 평균화 하 여 얻은 결과와 유사한 재현 가능한 결과를 제공 하는 것을 발견. 우리는 spermatheca의 중심에 이미지를 집중 하는 것이 좋습니다, 그러나 초점 평면은 실험 자의 필요에 따라 약간 변경 될 수 있습니다. 그러나 모든 이미지를 동일한 방식으로 촬영 하는 것이 중요 합니다. 또한, 초점이 있는 정자만 계산 하는 것이 중요 합니다. 그것은 초점 정자의 기준을 결정 하는 카운터의 재량 이다. 그러나 기준이 정량화 되는 모든 웜에 체계적으로 적용 되는 것이 중요 합니다. 정자 추적을 위해, 많은 소프트웨어는 자동 추적 기능을 제공 합니다. 그러나, 우리는 수동 추적이 두 가지 주요 이유로 소프트웨어의 자동 추적 알고리즘을 능가 하는 것을 발견: 1) 제한 된 공간 내에서 유사 하 게 크기의 핵의 풍요로 움이 어렵게 개별 정자를 구별 하는 소프트웨어 그리고 각 정자에 대해 정의 된 ROIs를 만듭니다. 2) 정자는 초점을 이동, 그들의 강도 이동, 어렵게 시간의 연장 된 기간 동안 정자를 추적 하는 소프트웨어에 대 한.
The authors have nothing to disclose.
우리는 진심으로 우리의 후기 멘토, 박사 마이클 밀러, 그의 영감과 사심 멘토링과 더 나은 정자 및 난 모 세포 통신을 이해 하는 도구로이 방법의 창조에 감사 합니다. 그의 갑작스런 통과는 그의 가족, 그의 실험실, 그리고 과학적인 공동체를 위한 엄청난 손실 이었습니다. 이 연구는 NIH (MAM 및 F30HD094446에 R01GM085105)에 의해 지원 되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이 며, 반드시 건강의 국가 학회 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Reagents and Material | |||
60mm x 15mm Petri Dish | Fisher | FB0875713A | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
N2 | CGC | N2 | |
fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
Platinum wire 0.25mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
Watch glass | Fisher | 02-612A | |
5mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20°C |
Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20°C. |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20°C |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
16°C and 20°C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |