Sperma muss erfolgreich durch den ovidukt navigieren, um eine Eizelle zu düngen. Hier beschreiben wir einen Test zur Messung der Spermienwanderung innerhalb der C. elegans Hermaphrodite uterus. Dieser Test kann quantitative Daten über die Spermienverteilung innerhalb der Gebärmutter nach der Paarung sowie über Geschwindigkeit, Richtgeschwindigkeit und Umkehrfrequenz liefern.
Eine erfolgreiche Befruchtung ist für die sexuelle Fortpflanzung von grundlegender Bedeutung, aber über die Mechanismen, die Spermien zu Eizellen innerhalb des weiblichen Fortpflanzungstraktes führen, ist wenig bekannt. Während in vitro-Studien suggeriert wird, dass Spermien von innerlich befruchtenden Tieren auf verschiedene Hinweise aus ihrer Umgebung reagieren können, schafft die Unfähigkeit, ihr Verhalten innerhalb des weiblichen Fortpflanzungstraktes zu visualisieren, eine Herausforderung für das Verständnis der Samenwanderung. Und Mobilität in der heimischen Umgebung. Hier beschreiben wir eine Methode mit C. elegans, die diese Einschränkung überwindet und ihre transparente Epidermis ausnutzt. C. elegans Männchen, die mit einem mitochondrialen Farbstoff gefärbt sind, werden mit erwachsenen Hermaphroditen gepaäuzt, die als modifizierte Weibchen wirken, und lagern fluoreszierend beschriftete Spermien in die Hermaphrodite Gebärmutter. Die Migration und die Beweglichkeit der beschrifteten Spermien können dann direkt mit einem Epi-Fornitätsmikroskop in einem lebenden Hermaphrodite verfolgt werden. Bei Wildtieren kriechen etwa 90% der beschrifteten Spermien durch die Gebärmutter und erreichen die Düngestelle, oder Spermatheca. Bilder der Gebärmutter können 1 h nach der Paarung genommen werden, um die Verteilung der Spermien innerhalb der Gebärmutter und den Prozentsatz der Spermien, die die Sperma erreicht haben, zu beurteilen. Alternativ können Zeitraffer-Bilder direkt nach der Paarung aufgenommen werden, um die Spermiengeschwindigkeit, die Richtgeschwindigkeit und die Umkehrfrequenz zu beurteilen. Diese Methode kann mit anderen genetischen und molekularen Werkzeugen kombiniert werden, die den C.eleganern zur Verfügung stehen, um neue genetische und molekulare Mechanismen zu identifizieren, die für die Regulierung von Spermienführung und Beweglichkeit innerhalb des weiblichen Fortpflanzungstraktes wichtig sind.
Die molekularen Mechanismen, mit denen Spermien (Spermien genannt) durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt in Richtung Eizelle navigieren, sind nicht gut verstanden, sind aber für die sexuelle Fortpflanzung grundlegend. Die Beweglichkeit der Spermien ist hochdynamisch und hängt von robusten Kommunikationssignalen ab, die die Spermiengeschwindigkeit und die Richtmotilität1,2, 3,4, 5,6verändern. , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. C. elegans ist ein mächtiges Modell für die Untersuchung von Spermienbewegung in vivo geworden, weil die transparente Epidermis der Hermaphrodite das Tracking von lebenden Spermien bei einer einzigen Zellauflösung2,3ermöglicht, 8,10. Der Zweck dieses Papiers ist es, Methoden zur Beurteilung der Spermienbewegung innerhalb der C. elegans Hermaphrodite Gebärmutter.
Bei Tierarten, bei denen Spermien und Eizelle in der äußeren Umgebung aufeinandertreffen (d.h. Erwerbsumgebungen), reagieren Spermien auf chemotaktische Signale, die von Eizellen ausgeschieden werden. Diese Signale leiten die Richtung der Spermienbewegung und bringen sie näher an dieSignalquelle 4,6,11heran. Viel weniger ist jedoch über die Spermienbewegung bei Arten bekannt, die intern düngen. Eine große Herausforderung ist die Architektur des weiblichen Fortpflanzungstraktes, der für die Mikroskopie bei den meisten Arten nicht zugänglich ist. In-vitro-Studien bei Menschen, Mäusen und Schweinen zum Beispiel liefern den Nachweis, dass Unterpopulationen von Spermien auf Chemoattractants, Flüssigkeitsfluss und thermische Verläufe 1,5, 7,9,reagieren können. 12. Mit diesen Systemen setzt die Unfähigkeit, die Spermienbewegung in vivo zu visualisieren und zu verfolgen, die Strategien zur Entdeckung der Schlüsselmechanismen, die diese Funktionen regulieren, stark ein.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir Methoden entwickelt, mit der Nematoden C. elegans , um Spermien nach der Befruchtung direkt zu visualisieren, einzelne Spermienwanderungsparameter in vivo zu messen und die Fähigkeit einer Spermienpopulation zu messen, gezielt zu zielen. Die Düngestelle. Diese Methoden, zusammen mit dem C. elegans molekularen und genetischen Werkzeugen, erleichtern die Entdeckung der chemischen Signalmoleküle und molekularen Maschinen, die Spermienmotilitätsverhalten regulieren. Zum Beispiel können genetische Bildschirme in Hermaphroditen oder Männern durchgeführt werden, um Gene zu identifizieren, die für eine effiziente Spermienbewegungin vivo 13 unerlässlich sind. Moleküle können in die Hermaphrodite-Gonade injiziert werden, um auf die Auswirkungen auf die Spermienaktivierung, die Migrationsgeschwindigkeit und die Richtmotilität3zu testen. Darüber hinaus können die beschriebenen Methoden zur Überwachung der Schurkensperrwanderung in ektopische Körperstandorte und zur Bewertung des Spermienwettbewerbs 10,14eingesetztwerden.
C. Eleger existieren in der Natur als Hermaphroditen und Männchen (siehe Abbildung 1). Die Hermaphrodite-Gonade hat zwei U-förmige Arme, die Spiegelbilder voneinander sind. Während des Larvenstadiums der L4-Larvenstufe werden die proximalsten Keimzellen (d.h. die Zellen in der Nähe der Spermatheca) einer Spermatogenese unterzogen. Jedes primäre Spermatozyt tritt in die Meiose ein und produziert vier haploide Spermien. Diese Spermien werden zusammen mit der ersten reifen Eizelle in die Spermatheca geschoben und werden einer Spermiogeneseunterzogen15. Erwachsene Hermaphroditen wechseln von der Spermatogenese zur Oogenese. Die Eizellen reifen in Fließband-Manier entlang der Gonade, mit der reifsten Eizelle am proximalen Ende der Gonade, neben der Spermatheca. MSP-Signale aus dem Sperma werden benötigt, um die meiotische Reifungund den Eisprung 16,17auszulösen. Männliche C. elegans hingegenhaben eine J-förmige Gonade, die nur Spermien hervorbringt. Die Spermien werden in der Samenvesicle gespeichert. Bei der Paarung mit der Hermaphrodite oder Weibchen fügt das Männchen die Schweine in der Nähe des Schwanzes in die Vulva ein. Spermatiden werden während der Ejakulation aktiviert, wenn sie mit der Samenflüssigkeit18in Kontakt kommen. C. elegans Spermien schwimmen nicht, da sie nicht geißelt sind. Stattdessen kriechen sie durch den Fortpflanzungstrakt und nutzen den Pseudopod zur Fortbewegung. Es ist gut etabliert, dass männliche Spermien, die größer sind, haben einen Wettbewerbsvorteil gegenüber Hermaphrodite Spermien14.
Bei dieser Methode fungieren männliche C. elegans als Samenspender und werden zu erwachsenen Hermaprhoditen gepaart. Erwachsene Männchen sind mit einem fluoreszierenden mitochondrialen Farbstoff gefärbt, um beschriftete Spermien zu produzieren. Einmal durch die Hermaphrodite Vulva abgelagert, muss das Sperma um die Embryonen in der Gebärmutter in Richtung der Spermatheca, oder Befruchtungsstelle kriechen. Die transparente Epidermis des C. elegans Modells ermöglicht die direkte Visualisierung jedes einzelnen Spermas, während es durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt navigiert. In den letzten Jahren hat unser Labor diese Methode erfolgreich eingesetzt, um die Bedeutung einer Klasse von F-Serien-Prostaglandinen in der Führung Spermienvonder Vulva bis zur Spermatheca 19,20zudemonstrieren. Die molekularen Mechaniken, die ihre Synthese durch die Hermaphrodite und die Reaktion der Spermien bestimmen, werden noch untersucht. Diese Methode zur Beurteilung von Beweglichkeit und Migration von Spermien erleichtert jedoch die Identifizierung der Schlüsselakteure, die die Kommunikation von Spermien und Eizellen bei der internen Befruchtung von Tieren kontrollieren. Das folgende Protokoll beschreibt Schritt für Schritt, wie dieser Test durchgeführt wird.
Die Fähigkeit von Spermien, den verschlungenen weiblichen Fortpflanzungstrakt zu navigieren und Eizellen zu finden, ist für die sexuelle Fortpflanzung entscheidend. Neuere Studien, in denen Spermien von intern düngenden Tieren verwendet werden, legen nahe, dass sie aktiv auf verschiedene Umweltarten reagieren, darunter chemische Signale, Flüssigkeitsfluss und Temperaturverläufe1,5,7, 9 , 12. Diese Beobachtungen sind jedoch weitgehend auf vitro-Experimente zurückzuführen, und über Spermienverhalten und Kommunikation innerhalb des Fortpflanzungstraktes ist wenig bekannt. Eine der Haupthindernisse für den Erwerb von Daten über Samenmigration und Beweglichkeit in vivo ist die mangelnde Sichtbarkeit in den meisten weiblichen Fortpflanzungsgebieten. Die Methode, die wir hier beschrieben haben, um C . elegans zu verwenden, überwindet diese Einschränkung. Wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen, ermöglicht die transparente Epidermis eine direkte Visualisierung und Verfolgung jedes Sammas bei der Auflösung von Einzelzellen in einem lebendigen, intakten Organismus.
C. elegans hat zwei Geschlechter. Die Männchen, mit einem XO-Genotyp, produzieren nur Spermien, und in dieser Methode, werden als Spermien Spender verwendet. Die Hermaphrodite, mit einem XX-Genotyp, sind modifizierte Weibchen. Ihre Gonaden durchlaufen zunächst im vierten Larvenstadium eine Spermatogenese und wechseln im Erwachsenenalter 25 auf Oogenese. In diesem Test werden erwachsene Hermaphroditen verwendet, deren Fortpflanzungsgewebe ein Modell für den weiblichen Fortpflanzungstrakt darstellen. Die Nutzung beider Geschlechter in diesem Test ermöglicht es uns, genetische und molekulare Wege sowohl in der männlichen als auch in der weiblichen, die Spermienführung und Beweglichkeit zu regulieren. In Kombination mit der ganzen Fülle von genetischen und molekularen Techniken, die für C.elegans zur Verfügung stehen, kann diese Methode zu neuartigen Einsichten in die Samenwanderung und die Beweglichkeit sowie in die Spermien-und Eizellkommunikation führen.
Einige kritische Schritte in diesem Protokoll rechtfertigen neben den Details, die im Protokollabschnitt angegeben sind, weitere Überlegungen.
Würmer
An Stelle vonN2-Männchen können mutzige Männchen verwendet werden , die sichin der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel de der Regel in der Regel in der Diese Mutationen erhöhen die Häufigkeit von Männern in Kulturen, aber nicht beeinflussen männliche Paarung oder Spermienfunktionen13. Weibchen, wie z.B . fog-2-q71) Weibchen, können anstelle von Hermaphroditen verwendet werden. Allerdings müssen Weibchen mit Männchen vorgepaßen werden, um eine richtige Eizellentwicklung zu ermöglichen. Das Vorhandensein von befruchteten Embryonen aus dieser Vorverpaarung sorgt auch dafür, dass die Gebärmutter lang genug ist, um die Spermienverteilung richtig zu beurteilen. Wenn Mutanten oder experimentelle Hermaphroditen bewertet werden, schließen Sie eine Kontrollgruppe ein. Zum Beispiel sollten mutierte Hermaphrodite mit Wildtyp N2 Hermaphroditen als Steuerung für andere Variablen im Test gepaart werden. Hermaphrodite, die mit Bakterien gefüttert wurden, die Plasmide für RNA-Interferenzuntersuchungen enthalten, sollten auch mit Bakterien gefüttert werden, die eine leere Vektorkontrolle enthalten. Der Abstand von der Vulva, in der Spermien befruchtet werden, zur Spermatheca, der Düngestelle, kann je nach Anzahl der Eier in der Gebärmutter variieren (d.h. die Gebärmutter dehnt sich mit zunehmender Eizellzahl aus). Wenn Vergleiche zwischen Genotypen vorgenommen werden, wählen Sie Hermaphroditen, deren Gebärmutter ähnliche Anzahl von Eiern enthält. Wählen Sie keine Hermaphroditen, die schlüpfende Embryonen oder bewegliche Larven enthalten. Es kann ein Zeitverlauf durchgeführt werden, um das optimale Alter zu ermitteln, in dem Hermaphrodite untersucht werden sollen.
Hermaphroditen und Männchen pflücken
Es ist wichtig, dass die Hermaphroditen, die für diesen Test ausgewählt wurden, nicht von überwucherten oder ausgehungerten Platten stammen. Lebensmittel-und Pheromoncues modulieren den Ausdruck von DAF-7, einem TGFß Homolog. Der DAF-7-Pfad wurde gezeigt, regelt die Synthese von F-Serien-Prostaglandinen, die eine wichtige Rolle bei der Führung Spermien zur Sperma20spielen. Hermaphroditen von überfüllten oder verhungerten Platten zu pflücken, kann zu einer schlechten Spermienführung führen, die nicht mit dem Ziel des Interesses in Verbindung steht. Die Dichte der Platten scheinen nicht auf die männlichen Spermien zu beeinflussen. Allerdings können Männer, die zu jung oder zu alt sind, zu einer verminderten Paarungseffizienz führen (d.h., das Prozent der Hermaphroditen auf der Paarungsplatte, die genug Spermien in ihren Gebärmutter haben, um zu quantifizieren). 1-3 Tage alte erwachsene Männer sind optimal für diesen Test23.
Hermaphroditen verhetzend
In unseren Händen sorgt die Kombination Tetramisole und Tricaine dafür, dass Würmer immobilisiert werden und während der Paarung und Bildaufnahme am Leben bleiben. Auch andere Anästhesie, wie Natriumazid, können verwendet werden. Natriumazid ist jedoch hochgiftig und die Bedingungen müssen standardisiert werden. Immobiliierungstechniken mit Mikroperlen, Acharose und Mikrofluidik-Kammern sind nicht zu empfehlen, da sie die Paarung stören.
Männliche Färbung
Der Mito-Farbstoff, der in diesem Manuskript verwendet wird, MitoTrackerCMXRos, wurde in C. elegansverwendet, um Spermien, sowie andere Mitochondrien, zu kennzeichnen. Das Sperma, das mit diesem Mito-Farbstoff gekennzeichnet ist, ist voll funktionsfähig, behält seine Fähigkeit, aktiviert zu werden, zu migrieren, Eizellen zu düngen und lebensfähige Nachkommen zu produzieren 26,27. Andere mitochondriale Farbstoffe, wie Rhodamine 6G und DiOC6,wurdenverwendet, um C. elegans Mitochondrien 28,29 zu verfärben. Allerdings müssen die Bedingungen für diese Farbstoffe für die Kennzeichnung von Spermien in diesem Test standardisiert werden. Neben mitochrondrialen Kennzeichnungsmechanismen können DNA-Flecken wie Syto17 auch zur Kennzeichnung von SpermienfürMigrationshintergrund 30 verwendet werden. Während diese Beschriftungstechniken relativ einfach und schnell durchzuführen sind, können transgene Strategien auch verwendet werden, um Spermien zu erzeugen, die fluoreszierende Tags unter SpermienspezifischePromoter 31,32ausdrücken.
paarung
Zu dick sind Mating Punkte, die die Paarungseffizienz verringern. Bei der Übertragung von Männchen und Betäubungsmittels auf den Paarungspunkt sollte darauf geachtet werden, möglichst wenig Bakterien zu übertragen.
Aergro-Pads herstellen und den Deckungszettel platzieren
Luftblasen können in den Agarchobstern erzeugt werden. Sie können Licht während der Bildaufnahme brechen oder, wenn sie groß genug sind, dazu führen, dass Würmer durchfallen, was es unmöglich macht, die Bilder zu erwerben. Ebenso können Luftblasen entlang der Hermaphroditen entstehen, wenn der Deckungsrutsch über sie auf dem Agarcha-Pad platziert wird. Diese Blasen brechen das Licht ab und führen zu einer verminderten Bildqualität. Die Praxis wird helfen, das Auftreten von Luftblasen zu verringern.
Quantifizierung
Bei der Quantifizierung der Spermienverteilung können verschiedene z-Ebenen durch die Gebärmutter eines Wurms leichte Unterschiede in der Spermienverteilung haben. Wir stellen fest, dass die Einnahme eines einzigen Bildes, das sich auf die Spermatheca konzentriert, uns reproduzierbare Ergebnisse liefert, die den Ergebnissen ähneln, die durch die Mittelung mehrerer z-Abschnitte erzielt werden. Wir empfehlen, das Bild auf die Mitte der Spermatheca zu konzentrieren, aber die Fokusebenen können je nach Bedarf des Experimentators leicht verändert werden. Kritisch ist aber, dass alle Bilder gleich aufgenommen werden. Außerdem ist es wichtig, dass nur Spermien gezählt werden, die im Fokus stehen. Es ist der Ermessensspielraum des Gegners bei der Bestimmung der Kriterien für In-Focus-Spermien. Entscheidend ist jedoch, dass die Kriterien systematisch auf jeden zu bezifferten Wurm angewendet werden. Für die Spermienverfolgung bieten viele Software automatische Tracking-Funktionen. Wir stellen jedoch fest, dass die manuelle Tracking-Funktion den automatischen Tracking-Algorithmus der Software aus zwei Hauptgründen übertrifft: 1) Die Fülle an ähnlich großen Kernen auf dem beengten Raum macht es für die Software schwierig, zwischen einzelnen Spermien zu unterscheiden. Und erstellen Sie definierte ROIs für jedes Sperma. 2) Während Spermien in und aus dem Fokus gehen, verschieben sich ihre Intensitäten, was es für die Software schwierig macht, den Überblick über die Spermien über längere Zeiträume zu behalten.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken unserem verstorbenen Mentor, Dr. Michael Miller, herzlich für seine inspirierende und selbstlose Mentorenschaft und die Schaffung dieser Methode als Werkzeug, um Spermien und Eizellkommunikation besser zu verstehen. Sein plötzliches Vergehen war ein enormer Verlust für seine Familie, sein Labor und die wissenschaftliche Gemeinschaft. Diese Studie wurde vom NIH (R01GM085105 bis MAM und F30HD094446 bis MH) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und vertritt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der Nationalen Gesundheitsinstitute.
Reagents and Material | |||
60mm x 15mm Petri Dish | Fisher | FB0875713A | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
N2 | CGC | N2 | |
fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
Platinum wire 0.25mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
Watch glass | Fisher | 02-612A | |
5mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20°C |
Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20°C. |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20°C |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
16°C and 20°C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |