具有温度控制功能的垂直观测显微镜级的制造
Summary
这里介绍的是一个使用温度控制的显微镜级的协议,它允许将样品容器安装在垂直显微镜上。
Abstract
样品通常放在水平显微镜台上进行微观观察。然而,为了观察重力对样品的影响或研究漂浮行为,有必要使显微镜阶段垂直。为此,设计了一个侧向倒置显微镜,倾斜90°。要用显微镜观察样品,必须将培养皿或玻璃玻片等样品容器垂直固定到舞台上。开发了一种在垂直显微镜舞台上将样品容器固定到位的装置,并在此进行了描述。此器件连接到该级允许观察垂直平面中的样品动力学。使用硅橡胶加热器调节温度的能力还允许观察温度相关样品行为。此外,温度数据传输到互联网服务器。温度设置和日志监控可以从 PC 或智能手机远程控制。
Introduction
光学显微镜是一种通过放大镜头和可见光的样品来增加可观察细节的技术。在光学显微镜中,光被定向到样品上,然后通过放大镜捕捉透镜进行反射、反射或荧光灯的捕获,以便观察。有多种显微镜在设计上有所不同,以适应不同的用途和观察方法。不同的设计包括立式显微镜,其结构是从下方照亮样品,以便从上面观察,以及倒置显微镜,从上面照亮样品,以便从下方观察。直立显微镜是最常见和广泛使用的设计。倒置显微镜通常用于观察不能让透镜与上方距离接近的样品,例如附着在容器底部的培养细胞。许多研究小组使用倒置显微镜1、2、3、4、5、6、7报告在广泛领域的观测结果。还开发了许多额外的设备,利用倒置显微镜8,9,10,11,12,13的功能.
目前,在所有传统的显微镜设计中,显微镜级是水平的,因此不适合观察在垂直平面上产生的样品运动(由于重力、浮力、运动等)。为了使这些观察成为可能,显微镜级和光路径必须旋转到垂直。垂直舞台需要垂直安装玻璃滑梯或样品容器,如培养皿到舞台上。为了解决这个问题,已经设计了一个侧向倒置显微镜,倾斜90°。但是,用胶带或其他粘合剂连接样品不会产生必要的长期静止状态。此处描述的是一种可实现必要稳定性的设备。此器件允许在垂直平面中观察样本随时间移动的时间。硅橡胶加热器的安装也使得观察温度变化对样品行为的影响成为可能。温度数据通过 Wi-Fi 传输到互联网服务器,温度设置和日志监控可以从 PC 或智能手机远程控制。据我们所知,在以前的研究中尚未报告附着在倾斜 90° 的侧向倾斜显微镜上的阶段。
显微镜阶段由三个铝板组成。中间铝板安装在连接到舞台的下部铝板上。含有温度传感器的硅橡胶连接在中铝板和上部铝板之间。橡皮筋用于粘贴样品。爪子附在上铝板的左右四个点,以固定橡胶带。温度调节器的控制电路接收嵌入硅橡胶的温度传感器的信号,并通过脉冲宽度调制(PWM)方法调节电能。温度可以1°C为增量逐渐升高至50°C。此器件适用于垂直采样运动可能依赖于温度的应用。
本报告提供了温度对硅藻浮现象的影响示例。作为硅藻观测研究的例子,细胞簇的沉积速度测量、运动分析、超细结构研究等已报告14、15、16、17,18,19,20,21,22,23.与光合生物一起漂浮在水中的硅藻的具体重力略高于水,因此容易下沉;然而,如果发生轻微的对流,它们也会上升。为了研究这一现象,玻璃滑动垂直地贴在显微镜的舞台上,并观察到温度升高对硅藻垂直运动的影响。
Protocol
1. 设计 铝板的制造 在尺寸为 150 mm x 200 mm x 2 mm 的铝板中心切割 101 mm 孔,用激光加工机用作最前沿板。机器爪子在八点,以贴上两个橡皮筋跨越的长度,或两个横跨这个板的宽度(参见补充图1A和补充图2A)。 在另一块 150 mm x 200 mm x 5 mm 铝板的中心切割一个 130 mm 孔,用激光加工机用作中上板。机器八个凹槽,用于在长度的两个点上连接橡皮筋,或两个穿过此板…
Representative Results
图 2显示了橡胶加热器的温度分布。橡胶加热器的表面温度在每个温度下都是均匀的。图 3显示了测量温度对设置温度变化的响应能力。橙色线显示设定的温度,蓝线显示样品温度的变化。测得的值对设置更改的过冲很小,跟踪速度很快。 观察到硅藻细胞,以提供使用此设备的特定示例?…
Discussion
运动硅藻细胞的轨迹分析是评估硅藻动性的有用方法。然而,虽然正常的倒置显微镜水平观察样品,但它不适合观察重力或垂直方向的浮动运动的影响。这里开发和描述的是一个垂直显微镜阶段,具有温度控制,并连接到倒置显微镜,已旋转90°。这种具有温度控制的显微镜阶段允许观察硅藻细胞的温度相关垂直运动。
协议中的一个关键步骤是控制器电路设计。为保证安全,采用了断?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者没有承认。
Materials
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30㎜ | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A – MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Biologie du développement. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM – selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields – A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates – potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion – An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
Citer Cet Article
Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).