Fabrikation af mikroskop Stage til vertikal observation med temperaturkontrol funktion
Summary
Præsenteret her er en protokol ved hjælp af en temperatur-kontrollerede mikroskop fase, der gør det muligt at montere en prøve container på et vertikalt mikroskop.
Abstract
Prøverne anbringes normalt på et horisontalt mikroskop stadie for mikroskopisk observation. Men for at observere indflydelsen af tyngdekraften på en prøve eller studere flydende adfærd, er det nødvendigt at gøre mikroskopet etape lodret. For at opnå dette, en sidelæns inverteret mikroskop vippes af 90 ° er blevet udtænkt. For at observere prøver med dette mikroskop skal prøvebeholdere som Petri skåle eller glas skred fastgøres til scenen lodret. En anordning, der kan sikre prøvebeholdere på plads på et vertikalt mikroskop stadie, er udviklet og beskrevet her. Fastgørelse af denne enhed til scenen tillader observation af prøve dynamik i det lodrette plan. Evnen til at regulere temperaturen ved hjælp af en silikone gummi varmer også tillader observation af temperaturafhængige prøve adfærd. Desuden overføres temperaturdataene til en Internet Server. Temperaturindstillinger og logovervågning kan fjernstyres fra en PC eller smartphone.
Introduction
Optisk mikroskopi er en teknik, der anvendes til at øge observerbare detaljer via forstørrelse af en prøve med linser og synligt lys. I Optisk mikroskopi, lys er rettet ind på en prøve, derefter transmitteres, afspejles, eller fluorescerende lys er fanget af Forstørrelsesglas linser til observation. Forskellige typer af mikroskop er tilgængelige, der adskiller sig i design til at rumme forskellige anvendelser og observation metoder. De forskellige designs omfatter et opretstående mikroskop, som er struktureret til at belyse en prøve nedefra for observation ovenfra og et inverteret mikroskop, som belyser prøven ovenfra for observation nedefra. Opretstående mikroskoper er den mest almindeligt og udbredte design. Inverterede mikroskoper bruges ofte til at observere prøver, der ikke kan tillade en linse tæt på afstand fra oven, såsom dyrkede celler klædes til bunden af en container. Mange forskergrupper har rapporteret observationer på en lang række områder ved hjælp af inverterede mikroskoper1,2,3,4,5,6,7. Mange ekstra enheder er også blevet udviklet, der udnytter funktionerne i inverterede mikroskoper8,9,10,11,12,13 .
I øjeblikket er mikroskop stadiet i alle konventionelle mikroskop konstruktioner vandret og er derfor uegnet til observation af prøver, der producerer bevægelse i det lodrette plan (på grund af tyngdekraft, flydeevne, bevægelse osv.). For at gøre disse observationer mulige, skal mikroskop scenen og lysstien drejes til lodret. Den lodrette fase er forpligtet til lodret montere glas skred eller prøvebeholdere såsom en Petri skåle til scenen. For at løse dette, en sidelæns inverteret mikroskop vippes af 90 ° er allerede blevet udtænkt. Fastgørelse af prøver med tape eller andre klæbemidler giver dog ikke den nødvendige langvarige immobilitet. Beskrevet her er en anordning, der kan opnå den nødvendige stabilitet. Denne anordning tillader observation over tid af prøve bevægelse i det lodrette plan. Montering af en silikone gummi varmer har også gjort det muligt at observere indflydelsen af temperatur variation på prøve adfærd. Temperatur data overføres til en Internet Server via Wi-Fi, og temperaturindstillinger og logovervågning kan fjernstyres fra en PC eller smartphone. Til vores viden, er scenen knyttet til en sidelæns vippes mikroskop vippes af 90 ° endnu ikke blevet rapporteret i tidligere undersøgelser.
Mikroskop scenen består af tre aluminiumsplader. Den midterste aluminiumsplade er monteret på den nederste aluminiumsplade, der bindes til scenen. Silikone gummiet, der indeholder temperatursensoren, er fastgjort mellem de midterste og øvre aluminiumsplader. Gummibånd anvendes til at anbringe prøven. Kløer er fastgjort i venstre og højre fire punkter i den øvre aluminiumsplade for at sikre gummibåndene. Temperatur regulatorens kontrolkredsløb modtager et signal fra Temperaturføleren indlejret i silikone gummi og modulerer elektrisk strøm ved at metoden Pulse width modulation (PWM). Temperaturen kan gradvist øges til 50 °C i intervaller på 1 °C. Denne enhed er nyttig til applikationer, hvor lodrette prøve bevægelser kan være temperaturafhængige.
Denne rapport giver eksempler på temperatur effekter på det flydende fænomen af diatomer. Som eksempler på Diatom observation undersøgelser, målinger af sedimentering hastighed af celle klynger, motion analyser, ultrafine strukturundersøgelser, etc. er blevet rapporteret14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. den specifikke tyngdekraft af diatomer flyder i vand med fotosyntetiske organismer er lidt højere end for vand, så de har tendens til at synke; Men, de vil stige, hvis selv let konvektion er forekommende. For at studere dette fænomen, er en glas slide anbringes lodret til et mikroskop fase, og virkningerne af stigende temperatur på Diatom lodrette bevægelse observeres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trajectory analyse af bevægelige Diatom celler er en nyttig tilgang til at evaluere Diatom motilitet. Men mens en normal inverteret mikroskop observerer prøver horisontalt, er det ikke egnet til observationer af påvirkning af tyngdekraften eller flydende bevægelse i den lodrette retning. Udviklet og beskrevet her er et vertikalt mikroskop stadie med temperaturstyring og fastgjort til et inverteret mikroskop, som er blevet roteret med 90 °. Dette mikroskop fase med temperaturkontrol tillader observation af temperatur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ingen bekræftelser.
Materials
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30㎜ | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A – MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM – selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields – A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates – potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion – An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
