Summary

Reinigung von Plateletten aus dem Mausblut

Published: May 07, 2019
doi:

Summary

Hier wurde in Anwesenheit eines Antikoagulanten Mausblut gesammelt. Die Blutplättchen wurden mit einer niedrigen Drehzahlenzentrifugation durch Iohexol-Gradientenmedium gereinigt. Die Blutplättchen wurden mit Thrombin aktiviert, um zu untersuchen, ob sie lebensfähig sind. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde durch Strömungszytometrie und Mikroskopie analysiert.

Abstract

Die Plateletten werden von Vollblut gereinigt, um ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, die frei sein sollten von roten Blutkörperchen (RBC), weißen Blutkörperchen (WBC) und Plasma-Proteinen. Wir beschreiben hier die Reinigung von Blutplättchen aus dem Mausblut mit dem Dreifach mehr Iohexol-Gradientenmittel im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Erträge der gereinigten Blutungen lagen bei 18,2-38,5%, und die gereinigten Blutplättchen befanden sich in einem ruhenden Zustand, der keine nennenswerte Anzahl von RBC und WBC enthielt. Die gereinigten Blutplättchen, die mit Thrombin behandelt wurden, zeigten bis zu 93% Aktivierung, was auf ihre Lebensfähigkeit hinweist. Wir haben bestätigt, dass die gereinigten Blutplättchen mit Hilfe von Strömungszytometrie und mikroskopischer Auswertung ausreichend rein sind. Diese Blutplättchen können für die Genexpression, Aktivierung, Granulatfreigabe, Aggregation und Haftungsanalysen verwendet werden. Diese Methode kann zur Reinigung von Blutplättchen aus dem Blut anderer Arten auch verwendet werden.

Introduction

Blutplättchen sind ein Bestandteil des Blutes, der als Initiator der Blutgerinnung als Reaktion auf Schäden im Blutgefäß fungiert. Sie versammeln sich an der Stelle der Verletzung, um die Gefäßwand1zu stopfen. Plattenets sind Zusammenhänge von Zytoplasma, die aus den Megakaryozyten des Knochenmarks unter dem Einfluss von Thrombopoietin abgeleitet werden und in den Kreislauf2gelangen. Sie gelten als metabolisch aktiv und können die extrazelluläre Umgebung durch die Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden erkennen, die zu der Ausbreitung, Aggregation und Hämodizatische Steckerbildung 1, 3führen. Neben der Hämostasis/Thrombose und der Wundheilung4spielen die Platten eine wichtige Rolle bei den Entzündungsreaktionen, der Angiogenese und den Metastatis3,5 , 6,7, 8.

Die Plateletten werden aus dem Blut gereinigt, um ihre biochemischen und physiologischen Eigenschaften zu untersuchen, die frei von anderen Blutbestandteilen sein sollten. Da rote Blutkörperchen (RBC) und weiße Blutkörperchen (WBC) deutlich mehr RNAundProteine enthalten als die Blutplättchen 9,10, kann das Vorhandensein von sogar einer kleinen Anzahl dieser Zellen mit transkriptomischen und proteomischen Analysen der RNA stören Und Proteine, die aus Blutplättchen stammen. Wir fanden heraus, dass gereinigte Blutplättchen, die mit Thrombin-Bind-Antikörper wie Anti-GPIIb/IIIa (JON/A) und Anti-P-Selektin aktiviert wurden, effizienter als Vollblutplüten.

Da die Blutplättchen zerbrechlich sind, ist es wichtig, die Proben möglichst milde zu behandeln. Wenn die Platten aktiviert sind, geben sie ihren Granulatgehalt frei und sinken schließlich ab. Um die funktionellen Eigenschaften der Platelette intakt zu halten, ist es daher wichtig, die Ruhe während der Isolation zu erhalten. Mehrere Protokolle haben die Isolierung von Blutplättchen von menschlichem, Hund, Ratte und nicht-menschlichem Primat mit verschiedenen Methoden1,10,11, 12beschrieben. Einige der Methoden erfordern mehrere Schritte wie das Sammeln von platelettreichem Plasma durch Zentrifugation, Filtration durch Trennsäule, negative Auswahl von Blutplättchen mit RBC-und WBC-spezifischen Antikörper, die mit Magnetperlen konjugiert werden, und so weiter, die Zeitaufwendig und kann Blutplättchen und deren Inhalt abbauen.

Ford und seine Kollegen beschrieben die Platelet-Reinigung aus menschlichem Blut mit Iohexol Medium11. Diese Methode verwendet ein ähnliches Volumen der Blutprobe und Medium während der Reinigung. Da der Mensch ein höheres Blutvolumen erweist, ist es relativ einfach, die Blutplättchen zu reinigen.

Iohexol ist ein universelles Dichtegradienten-inertes Medium, das frei im Wasser löslich ist und bei der Fraktionierung von Nukleinsäuren, Proteinen, Polysacchariden und Nukleoproteinen 13,14verwendet wird. Es hat eine geringe Osmolalität und ist ungiftig, so dass es ein ideales Medium für die Reinigung vonintakten lebenden Zellen 11. Es ist ein nicht-partikelfreies Medium; So kann die Verteilung der Zellen in einem Farbverlauf mit Hämozytometer, Strömungszytometer oder Spektrophotometer bestimmt werden. Es stört nicht die meisten enzymatischen oder chemischen Reaktionen der Zellen oder Zellfragmente nach der Verdünnung.

Die Maus dient als wichtiges Tiermodell für viele menschliche Krankheiten15, 16,17,18. Es gibt ein paar veröffentlichte Artikel, die die Reinigung von Maus-Platten 19,20beschreiben. Allerdings liefert die Maus ein relativ geringeres Blutvolumen, was die Reinigung von Blutplättchen erschwert. Wird das gleiche geringe Volumen an GradientenMittel-und Blutproben verwendet, kann die Plattenschicht nach der Zentrifugation nicht eindeutig von der RBC-WBC-Schicht getrennt werden. In diesem Artikel haben wir eine schnelle und einfache Methode der Maus-Plattenreinigung mit dreifach mehr Iohexol-Gradientenmedium im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der niedrigen Geschwindigkeit Zentrifugation beschrieben. Wir haben auch die gereinigten Blutplättchen mit Thrombin aktiviert und ihre Qualität mit Strömungszytometrie und Mikroskopie untersucht.

Protocol

Die Blutentnahme von Maus sollte mit entsprechender institutioneller Tierpflege und Zustimmung des Ausschusses durchgeführt werden. NOTE: Das Platelet-Reinigungsprotokoll wird in einem Strömungsdiagramm in Abbildung1 beschrieben. 1. Sammlung von Blut 25 μL von 3,2% Natriumcitrat (pH 7,2) als Anti-Gerinnungsmittel und 0,4 mM Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) in ein Polypropylen-Rohr geben. Sammeln Si…

Representative Results

Die Zusammenfassung der Plattenreinigung wird in einem Strömungsdiagramm beschrieben (Abbildung 1). Zu den Schritten gehören die Blutentnahme von der Maus mit Retro-Orbitalblutungen in Anwesenheit eines Gerinnungshaus, die Zugabe von Blutprobe auf das Iohexol-Gradientenmedium, Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde nach der Färbung mit Antikörper mit Mikroskopie und Strömungszytome…

Discussion

Häufig werden Blutplättchen durch eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit isoliert, die plateletreichem Plasma liefert, das eine beträchtliche Anzahl von Blutkörperchen, Zellabfall und Plasmaproteinen enthält, die die biochemischen und physiologischen Assays und Bedürfnisse stören können. Weitere Reinigung21. Daher ist es wichtig, eine schnelle und einfache Methode zu verwenden, die reine Blutplättchen ohne größere Verunreinigungen erzeugen kann. Das hier vorgestellte Protokol…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch eine Start-up-Finanzierung der Cincinnati Children es Research Foundation und ein Stipendium der Universität von Cincinnati Pilot Translational Granate an M.N. Wir danken dem Cincinnati Children es Hospital Research Flow Cytometry Core für seine Dienste.

Materials

APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) Thermoscientific 17-0626-82 Platelets activation marker
Eppendorf tube Fisher Scientific 14-222-166 Tube for centifuge
FACS DIVA software BD Biosciences Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
FACS tube Fisher Scientific 352008 Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 26140079 Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41 BD Biosciences 553848 Platelets marker
Flow cytometer BD Biosciences Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
FlowJo software FlowJo, Inc. Non-catalog item Analysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) EMD Millipore 03-34-0001 Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tube Fisher Scientific 22-362566 Blood collection capillary tube
Hemavet Drew Scientific Non-catalog item Blood cell analyzer
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 Cell counting chamber
Isoflurane Baxter 1001936040 Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz) Sigma-Aldrich D2158 Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45 BD Biosciences 561087 WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 BD Biosciences 557853 RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-bore ThermoFisher Scientific 21-236-1A Transferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-bore ThermoFisher Scientific 21-236-2C Transferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS) ThermoFisher Scientific 14040-117 Buffer for washing and dilution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Physiological saline
Sodium citrate Fisher Scientific 02-688-26 Anti-coagulant
Staining buffer In-house Non-catalog item Wash and dilution buffer
Steile water In-house Non-catalog item Solvent
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 Swinging bucket rotor centrifuge
Thrombin Enzyme Research Laboratoty HT 1002a Platelet activation agonist
Tricine Sigma-Aldrich T0377 Buffer for Nycodenz medium

References

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Citer Cet Article
Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of Platelets from Mouse Blood. J. Vis. Exp. (147), e59803, doi:10.3791/59803 (2019).

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