Очищение тромбоцитов от мышонка крови
Summary
Здесь, мышь кровь была собрана в присутствии анти-коагулянт. Тромбоциты были очищены от iohexol градиент среды с использованием низкой скорости центрифугирования. Тромбоциты были активированы с тромбина для расследования, если они были жизнеспособными. Качество очищенных тромбоцитов анализировалось с помощью потока цитометрии и микроскопии.
Abstract
Тромбоциты очищаются от цельной крови для изучения их функциональных свойств, которые должны быть свободны от красных кровяных телец (РБК), лейкоцитов (WBC), и белков плазмы. Мы описываем здесь очищение тромбоцитов от мыши крови, используя три раза больше iohexol градиент среднего относительно объема крови и центрифугирования в размахивая ведро ротора на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c. Восстановление/выход очищенных тромбоцитов было 18.2-38.5%, а очищенные тромбоциты находились в состоянии покоя, которое не содержало сколь-либо значительного количества РБК и WBC. Очищенные тромбоциты, обработанные тромбином, показали до активации 93%, что указывает на их жизнеспособность. Мы подтвердили, что очищенные тромбоциты являются достаточно чистым использованием потока цитометрической и микроскопической оценки. Эти тромбоциты могут использоваться для экспрессии генов, активации, высвобождения гранул, агрегирования и анализа адгезии. Этот метод может быть использован для очистки тромбоцитов из крови других видов, а также.
Introduction
Тромбоциты являются компонентом крови, который функционирует как инициатор свертывания крови в ответ на повреждение в кровеносный сосуд. Они собирают на месте повреждения для того чтобы заткнуть стену сосуда1. Тромбоциты являются ануклеатными фрагментами цитоплазмы, производными от мегакарыцитов костного мозга под действием тромбоноэтин и попадают в тираж2. Они считаются метаболически активными и способными воспринимать внеклеточную среду путем активации внутриклеточных сигнальных каскадов, которые приводят к распространению тромбоцитов, агрегированию и образованию гемостатической вилки1,3. Помимо гемостаза/тромбоза и заживления ран4, тромбоциты играют важную роль в принимающих воспалительных реакций, ангиогенез, и метагатис3,5,6,7, 8.
Тромбоциты очищают от крови для изучения их биохимических и физиологических свойств, которые должны быть свободны от других компонентов крови. Поскольку эритроциты (РБК) и лейкоциты (WBC) содержат значительно больше РНК и белков, чем тромбоциты9,10, наличие даже небольшого количества этих клеток может мешать транскриптомической и протеомической аналитикам РНК и белков, полученных из тромбоцитов. Мы обнаружили, что очищенные тромбоциты активируются с антителом тромбина антитела, такие как анти-GPIIb/IIIa (Джон/а) и анти-P-selectin более эффективно, чем целые тромбоциты крови.
Так как тромбоциты хрупкие, важно, чтобы обработать образцы как можно более мягко. Если тромбоциты активированы, они выпускают содержимое гранул и в конечном счете деградируют. Поэтому, чтобы сохранить функциональные свойства тромбоцитов нетронутыми, важно поддерживать старение тромбоцитов во время изоляции. Несколько протоколов описали изоляцию тромбоцитов от человека, собаки, крысы, и не-человека приматов различными методами1,10,11,12. Некоторые из методов требуют несколько этапов, таких как сбор обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрифугирования, фильтрации путем разделения колонки, отрицательный выбор тромбоцитов с РБК-и WBC-специфические антитела, сопряжения к магнитным бисером, и так далее, которые являются отнимает много времени и может ухудшить тромбоциты и их содержимое.
Форд и его коллеги описали очищение тромбоцитов от человеческой крови с помощью iohexol средних11. Этот метод использует аналогичный объем проб крови и средних во время очистки. В виду того что люди дают более высокий объем крови, оно относительно легки для того чтобы очистить тромбоциты.
Iohexol является универсальным градиентом плотности инертной среде, которая свободно растворяется в воде и используется в фракционирование нуклеиновых кислот, белков, полисасахадов, и нуклеопротеидов13,14. Он имеет низкую осмолальность и нетоксичен, тем самым делая его идеальной средой для очищения неповрежденными живыми клетками11. Это не-твердых частиц среды; Таким образом, распределение ячеек в градиенте можно определить с помощью хемоцитометер, Flow cytometer, или спектрофотометра. Он не мешает большинству ферментативной или химической реакции клеток или клеточных фрагментов после разбавления.
Мышь служит важной моделью животных для многих заболеваний человека15,16,17,18. Есть несколько опубликованных статей, которые описывают очищение мыши тромбоцитов19,20. Однако, мышь дает относительно меньший объем крови, что затрудняет очищение тромбоцитов. Если используется тот же малый объем градиента средних и образцов крови, то слой тромбоцитов не может быть четко отделен от слоя РБК-WBC после центрифугирования. В этой статье мы описали быстрый и простой метод очистки мыши тромбоцитов с три раза больше iohexol градиент среды относительно объема выборки крови и низкой скорости центрифугирования. Мы также активировали очищенную тромбоциты с тромбин и исследовали их качество с потоком цитометрии и микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обычно тромбоциты изолированы низкоскоростным центрифугирования, которая дает богатую тромбоцитами плазму, которая содержит значительное количество клеток крови, клеточного мусора и белков плазмы, которые могут вмешиваться в биохимические и физиологические анализы и потребности д?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана запуска финансирования детского исследовательского фонда Цинциннати и Университета Цинциннати пилот поступательный Грант на М.Н. Мы хотели бы поблагодарить детский госпиталь Цинциннати исследовательский поток Цитометрическая Core за их услуги.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets’ Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
