Purificación de plaquetas de la sangre del ratón
Summary
Aquí, la sangre del ratón se recogió en presencia de un anticoagulante. Las plaquetas fueron purificadas por medio degradado de iohexol utilizando centrifugación de baja velocidad. Las plaquetas se activaron con trombina para investigar si eran viables. La calidad de las plaquetas purificadas fue analizada por citometría de flujo y microscopía.
Abstract
Las plaquetas se purifican de la sangre entera para estudiar sus propiedades funcionales, que deben estar libres de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC) y proteínas plasmáticas. Describimos aquí la purificación de las plaquetas de la sangre del ratón usando un medio degradado de tres veces más iohexol en relación con el volumen de la muestra de sangre y la centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La recuperación/rendimiento de las plaquetas purificadas fue de 18.2-38.5%, y las plaquetas purificadas estaban en un estado de reposo, que no contenía ningún número significativo de RBC y WBC. Las plaquetas purificadas tratadas con trombina mostraron hasta el 93% de activación, indicando su viabilidad. Confirmamos que las plaquetas purificadas son lo suficientemente puras utilizando citometría de flujo y evaluación microscópica. Estas plaquetas se pueden utilizar para la expresión génica, activación, liberación de gránulos, agregación y ensayos de adherencia. Este método se puede utilizar para la purificación de las plaquetas de la sangre de otras especies, así.
Introduction
Las plaquetas son un componente de la sangre que funciona como un iniciador de la coagulación de la sangre en respuesta al daño en el vaso sanguíneo. Se reúnen en el lugar de la lesión para tapar la pared del recipiente1. Las plaquetas son fragmentos de anucleato de citoplasma derivados de los megacuariocitos de la médula ósea bajo la influencia de la trombopoyetina y entran en la circulación2. Se consideran como metabólicamente activos y capaces de detectar el entorno extracelular activando las cascadas de señalización intracelulares que resultan en la propagación de plaquetas, la agregación y la formación de tapón hemostático1,3. Además de la hemostasia/trombosis y la cicatrización de heridas4, las plaquetas desempeñan un papel importante en las respuestas inflamatorias del huésped, angiogénesis y nódulos3,5,6,7, 8.
Las plaquetas se purifican de la sangre para estudiar sus propiedades bioquímicas y fisiológicas, que deben estar libres de otros componentes de la sangre. Dado que los glóbulos rojos (RBC) y los glóbulos blancos (WBC) contienen significativamente más ARN y proteínas que las plaquetas9,10, la presencia de incluso un pequeño número de estas células puede interferir con análisis transcriptómicos y proteómicas de ARN y proteínas derivadas de las plaquetas. Descubrimos que las plaquetas purificadas se activaron con anticuerpos de enlace de trombina como anti-GPIIb/IIIa (JON/A) y anti-P-selectin de manera más eficiente que las plaquetas sanguíneas enteras.
Dado que las plaquetas son frágiles, es importante tratar las muestras de la forma más leve posible. Si las plaquetas están activadas, liberan su contenido de gránulo y finalmente se degradan. Por lo tanto, para mantener intactas las propiedades funcionales de las plaquetas, es importante mantener la quiescencia plaquetaria durante el aislamiento. Varios protocolos han descrito el aislamiento de las plaquetas de humano, perro, rata y primates no humano por varios métodos1,10,11,12. Algunos de los métodos requieren múltiples pasos como la recolección de plasma rico en plaquetas por centrifugación, filtración por columna de separación, selección negativa de plaquetas con anticuerpos específicos de RBC y WBC conjugados con cuentas magnéticas, y así sucesivamente, que son consume mucho tiempo y puede degradar las plaquetas y su contenido.
Ford y sus colegas describieron la purificación plaquetaria de sangre humana usando iohexol medio11. Este método utiliza un volumen similar de muestra de sangre y medio durante la purificación. Dado que los seres humanos producen un mayor volumen de sangre, es relativamente fácil purificar las plaquetas.
Iohexol es un medio inerte de gradiente de densidad universal que es libremente soluble en agua y utilizado en el fraccionamiento de ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos, y nucleoproteínas13,14. Tiene baja osmolalidad y no es tóxico, por lo que es un medio ideal para la purificación de las células vivas intactas11. Es un medio no particulado; por lo tanto, la distribución de las células en un degradado se puede determinar mediante hemocitómetro, CITOMETRO de flujo o espectrofotómetro. No interfiere con la mayoría de las reacciones enzimáticas o químicas de las células o fragmentos celulares después de la dilución.
El ratón sirve como un modelo animal importante para muchas enfermedades humanas15,16,17,18. Hay algunos artículos publicados que describen la purificación de las plaquetas del ratón19,20. Sin embargo, el ratón produce un volumen de sangre relativamente más pequeño, lo que dificulta la purificación de las plaquetas. Si se utiliza el mismo volumen pequeño de medio degradado y muestras de sangre, la capa plaquetaria no puede separarse claramente de la capa de RBC-WBC después de la centrifugación. En este artículo, hemos descrito un método rápido y simple de purificación de plaquetas de ratón con tres veces más medio degradado iohexol en relación con el volumen de la muestra de sangre y la centrifugación de baja velocidad. También hemos activado las plaquetas purificadas con trombina e investigado su calidad con citometría de flujo y microscopía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comúnmente, las plaquetas se aíslan por centrifugación de baja velocidad que produce plasma rico en plaquetas que contiene un número significativo de células sanguíneas, desechos celulares y proteínas plasmáticas que pueden interferir con los ensayos y necesidades bioquímicos y fisiológicos purificación adicional21. Por lo tanto, es importante utilizar un método rápido y simple que puede producir plaquetas puras sin contaminantes importantes. El protocolo presentado aquí describe la …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una financiación inicial de la Fundación de investigación infantil de Cincinnati y una subvención translacional de la Universidad de Cincinnati a M.N. Nos gustaría agradecer el núcleo de la citometría de flujo de investigación de Cincinnati children’s hospital por sus servicios.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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