Rening av trombocyter från mus blod
Summary
Här, mus blod samlades i närvaro av en antikoagulantia. Trombocyterna renades av Johexol gradient medium med lågfart centrifugering. Trombocyterna aktiverades med trombin för att undersöka om de var livskraftiga. Kvaliteten på de renade trombocyterna analyserades genom flödescytometri och mikroskopi.
Abstract
Trombocyter renas från helblod för att studera deras funktionella egenskaper, som bör vara fria från röda blod kroppar (RBC), vita blod kroppar (WBC), och plasma proteiner. Vi beskriver här rening av blodplättar från mus blod med tre gånger mer Johexol gradient medium i förhållande till blod prov volym och centrifugering i en sväng ande hink rotor på 400 x g för 20 min vid 20 ° c. Återhämtningen/avkastningen av de renade trombocyter var 18,2-38,5%, och de renade trombocyter var i ett vilo tillstånd, som inte innehöll något betydande antal RBC och WBC. De renade trombocyter som behandlades med trombin visade upp till 93% aktivering, vilket indikerar deras lönsamhet. Vi bekräftade att de renade trombocyterna är tillräckligt rena med flödescytometrisk och mikroskopisk utvärdering. Dessa trombocyter kan användas för gen uttryck, aktivering, granule release, agg regering, och vidhäftning analyser. Denna metod kan användas för rening av blodplättar från blodet av andra arter samt.
Introduction
Trombocyter är en del av blod som fungerar som en initiativtagare till blodkoagulering som svar på skador i blod kärlet. De samlas på platsen för skada för att ansluta fartygs väggen1. Trombocyter är anucleate fragment av cytoplasman härrör från megakaryocyter i benmärgen under påverkan av trombopoietin och in i cirkulationen2. De anses vara metaboliskt aktiva och kan känna av extracellulär miljö genom att aktivera intracellulära signalering kaskader som resulterar i trombocyt spridning, agg regering, och hemostatiska plugg formation1,3. Förutom hemostas/trombos och sårläkning4, trombocyter spelar en viktig roll i värd inflammatoriska reaktioner, angiogenes, och metastatis3,5,6,7, och 8.
Trombocyter renas från blod för att studera deras biokemiska och fysiologiska egenskaper, som bör vara fria från andra blod komponenter. Eftersom röda blod kroppar (RBC) och vita blod kroppar (WBC) innehåller signifikant mer RNA och proteiner än trombocyter9,10, närvaron av även ett litet antal av dessa celler kan störa transkriptomiska och proteomiska analyser av RNA och proteiner som härrör från trombocyter. Vi fann att renade trombocyter aktive ras med trombin bind anti kropp som anti-GPIIb/IIIa (JON/A) och anti-P-selektin mer effektivt än hela blodplättar.
Eftersom trombocyter är bräckliga är det viktigt att behandla proverna så milt som möjligt. Om trombocyterna aktive ras, släpper de sina granule innehåll och i ändan försämras. För att hålla Trombocyternas funktionella egenskaper intakt är det därför viktigt att bibehålla trombocyt aggregation under isolering. Flera protokoll har beskrivit isolering av trombocyter från människa, hund, råtta, och icke-mänskliga primater av olika metoder1,10,11,12. Några av metoderna kräver flera steg såsom insamling av trombocytrik plasma genom centrifugering, filtrering av separations kolonnen, negativt urval av blodplättar med RBC-och WBC-specifik anti kropp konjugerad till magnetiska pärlor, och så vidare, som är tids krävande och kan försämra antalet blodplättar och deras innehåll.
Ford och hans kollegor beskrev trombocyt rening från humant blod med hjälp av Johexol medium11. Denna metod använder en liknande volym blod prov och medium under rening. Eftersom människor ger en högre volym av blod, är det relativt lätt att rena trombocyterna.
Iohexol är en universell densitet gradient inert medium som är fritt lösligt i vatten och används i fraktionering av nukleinsyror, proteiner, polysackarider, och nukleoproteiner13,14. Den har låg osmolalitet och är giftfri, vilket gör det till ett idealiskt medium för rening av intakt levande celler11. Det är ett icke-partikelformigt medel; Därför kan fördelningen av celler i en gradient bestämmas med hjälp av hemocytometer, flödescytometern eller spektrofotometer. Det stör inte de flesta av de enzymatiska eller kemiska reaktionen av cellerna eller cellulära fragment efter spädning.
Musen fungerar som en viktig djur modell för många mänskliga sjukdomar15,16,17,18. Det finns några publicerade artiklar som beskriver rening av muplättarna19,20. Men musen ger en relativt mindre mängd blod, vilket gör det svårt att rena trombocyter. Om samma lilla volym av gradientsubstrat och blod prov används, kan inte trombocyt skiktet tydligt separeras från RBC-WBC-skiktet efter centrifugering. I denna artikel, vi har beskrivit en snabb och enkel metod för musens trombocyt rening med tre gånger mer Johexol gradient medium i förhållande till blod prov volym och lågfart centrifugering. Vi har också aktiverat de renade trombocyter med trombin och undersökt deras kvalitet med flödescytometri och mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanligt vis, trombocyter isoleras genom låg hastighet centrifugering som ger trombocyt rik plasma som innehåller ett stort antal blod kroppar, cellulära skräp, och plasma proteiner som kan störa den biokemiska och fysiologiska analyser och behov ytterligare rening21. Därför är det viktigt att använda en snabb och enkel metod som kan ge rena blodplättar utan större föroreningar. Det protokoll som presenteras här beskriver rening av blodplättar från mus blod med hjälp av ett gradient…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en start-up finansiering av Cincinnati Children ‘ s Research Foundation och ett University of Cincinnati pilot translational bidrag till M.N. Vi vill tacka Cincinnati Children ‘ s Hospital forskning Flow Cytometry Core för sina tjänster.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets’ Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
