Summary
Her ble mus blod samlet i nærvær av en anti-koagulere. Blodplatene ble renset ved iohexol gradient medium ved hjelp av lav hastighet sentrifugering. Blodplatene ble aktivert med trombin for å undersøke om de var levedyktige. Kvaliteten på de renset blodplatene ble analysert av Flow flowcytometri og mikroskopi.
Abstract
Blodplater er renset fra hele blodet til å studere deres funksjonelle egenskaper, som bør være fri fra røde blodlegemer (RBC), hvite blodlegemer (WBC), og plasmaproteiner. Vi beskriver her rensing av blodplater fra mus blod ved hjelp av tre-fold mer iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volum og sentrifugering i en svingende bøtte rotoren på 400 x g for 20 min ved 20 ° c. Utvinningen/utbyttet av renset blodplater var 18.2-38.5%, og renset blodplater var i hviletilstand, som ikke inneholder noen betydelig antall RBC og WBC. De renset blodplater behandlet med trombin viste opp til 93% aktivisering, indikerer deres levedyktighet. Vi har bekreftet at de renset blodplatene er tilstrekkelig rene ved bruk av strømnings analytiske og mikroskopisk evaluering. Disse blodplater kan brukes til genuttrykk, aktivisering, granule utgivelse, aggregering, og vedheft analyser. Denne metoden kan brukes for rensing av blodplater fra blodet til andre arter også.
Introduction
Blodplater er en del av blodet som fungerer som en initiativtaker til blodpropp som svar på skade i blodkaret. De samles på stedet av skade for å plugge fartøyet veggen1. Blodplater er anucleate fragmenter som stammer fra megakaryocytter av benmargen under påvirkning av thrombopoietin og angi sirkulasjon2. De regnes som metabolically aktiv og i stand til sensing ekstracellulære miljø ved å aktivere intracellulære signalering kaskader som resulterer i blodplater sprer seg, aggregering, og hemostatic plug formasjon1,3. Foruten hemostase/trombose og sår helbredelse4, blodplater spille en viktig rolle i Host inflammatoriske responser, angiogenese, ogmetastatis 3,5,6,7, 8i den.
Blodplater er renset fra blodet til å studere sine biokjemiske og fysiologiske egenskaper, som skal være fri for andre blodkomponenter. Siden røde blodlegemer (RBC) og hvite blodlegemer (WBC) inneholder betydelig mer RNA og proteiner enn blodplater9,10, kan tilstedeværelsen av selv et lite antall av disse cellene forstyrre transcriptomic og Proteomikk analyser av RNA og proteiner avledet fra blodplater. Vi fant at renset blodplater aktivert med trombin bind antistoff som anti-GPIIb/IIIa (JON/A) og anti-P-selectin mer effektivt enn hele blodplater.
Siden blodplater er skjøre, er det viktig å behandle prøvene så mildt som mulig. Hvis blodplatene er aktivert, slipper de sitt granule innhold og til slutt brytes ned. Derfor, for å holde blodplater funksjonelle egenskaper intakt, er det viktig å opprettholde blodplate fredfulle omgivelser under isolasjon. Flere protokoller har beskrevet isolering av blodplater fra menneske, hund, rotte, og ikke-menneskelige primater av ulike metoder1,10,11,12. Noen av metodene krever flere trinn som for eksempel innsamling av blodplater-rik plasma av sentrifugering, filtrering av separasjon kolonne, negativt utvalg av blodplater med RBC-og WBC-spesifikke antistoff bøyd til magnetiske perler, og så videre, som er tidkrevende og kan svekke blodplater og deres innhold.
Ford og kollegene hans beskrev blodplate rensing fra humant blod ved hjelp av iohexol medium11. Denne metoden bruker et lignende volum av blodprøve og medium under rensing. Siden mennesker gir et høyere volum av blod, er det relativt lett å rense blodplater.
Iohexol er en Universal Density gradient inert medium som er fritt oppløselig i vann og brukes i fraksjonering av nukleinsyre syrer, proteiner, polysakkarider, og nucleoproteins13,14. Det har lav osmolalitet og er ikke giftig, og dermed gjør det til et ideelt medium for rensing av intakt levende celler11. Det er et ikke-partikkel medium; fordelingen av celler i en gradering kan derfor bestemmes ved hjelp av hemocytometer, flyt flowcytometer eller spektrofotometer. Det forstyrrer ikke det meste av enzymatisk eller kjemisk reaksjon av cellene eller cellulære fragmenter etter fortynning.
Musa fungerer som en viktig dyremodell for mange menneskelige sykdommer15,16,17,18. Det er noen publiserte artikler som beskriver rensing av musen blodplater19,20. Men musen gir et relativt mindre volum av blod, noe som gjør det vanskelig å rense blodplater. Hvis det samme lille volumet av gradient medium og blodprøver er brukt, kan blodplater laget ikke klart skilles fra RBC-WBC lag etter sentrifugering. I denne artikkelen har vi beskrevet en rask og enkel metode for mus blodplater rensing med tre ganger mer iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volum og lav hastighet sentrifugering. Vi har også aktivert renset blodplater med trombin og undersøkt deres kvalitet med Flow flowcytometri og mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanligvis er blodplater isolert med lav hastighet sentrifugering som gir blodplater rik plasma som inneholder et betydelig antall blodlegemer, cellulære rusk, og plasmaproteiner som kan forstyrre de biokjemiske og fysiologiske analyser og behov ytterligere rensing21. Derfor er det viktig å bruke en rask og enkel metode som kan gi rene blodplater uten store forurensninger. Protokollen som presenteres her beskriver rensing av blodplater fra mus blod ved hjelp av en gradient medium med lav hastighe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en oppstart finansiering av Cincinnati Children ‘ s Research Foundation og et universitet i Cincinnati pilot translational stipend til M.N. Vi vil gjerne takke Cincinnati Children ‘ s Hospital Research Flow flowcytometri Core for sine tjenester.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets’ Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
