Purification des plaquettes du sang de souris

Summary

Ici, le sang de la souris a été recueilli en présence d’un anti-coagulant. Les plaquettes ont été purifiées par le milieu gradient Iohexol en utilisant une centrifugation à faible vitesse. Les plaquettes ont été activées avec la thrombine pour enquêter si elles étaient viables. La qualité des plaquettes purifiées a été analysée par cytométrie en flux et microscopie.

Abstract

Les plaquettes sont purifiées du sang entier pour étudier leurs propriétés fonctionnelles, qui doivent être exemptes de globules rouges (RBC), de globules blancs (WBC) et de protéines plasmatiques. Nous décrivons ici la purification des plaquettes du sang de souris en utilisant trois fois plus de milieu de gradient d’Iohexol par rapport au volume d’échantillon sanguin et la centrifugation dans un rotor de godet oscillant à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c. La récupération/rendement des plaquettes purifiées était de 18,2-38,5%, et les plaquettes purifiées étaient dans un état de repos, ce qui ne contenait aucun nombre significatif de RBC et de WBC. Les plaquettes purifiées traitées avec la thrombine ont montré une activation jusqu’à 93%, ce qui indique leur viabilité. Nous avons confirmé que les plaquettes purifiées sont suffisamment pures en utilisant l’évaluation cytométrique et microscopique du flux. Ces plaquettes peuvent être utilisées pour l’expression génique, l’activation, la libération de granule, l’agrégation et les essais d’adhérence. Cette méthode peut être utilisée pour la purification des plaquettes du sang d’autres espèces ainsi.

Introduction

Les plaquettes sont un composant du sang qui fonctionne comme un initiateur de la coagulation sanguine en réponse aux dommages dans le vaisseau sanguin. Ils se réunissent sur le site de blessure pour brancher la paroi du navire¹. Les plaquettes sont des fragments anucléés de cytoplasme dérivés des mégakaryocytes de la moelle osseuse sous l’influence de la thrombopoïétine et entrent dans la circulation². Ils sont considérés comme métaboliquement actifs et capables de détecter l’environnement extracellulaire en activant des cascades de signalisation intracellulaires qui entraînent une propagation plaquettaire, une agrégati....

Protocol

La collecte de sang de souris doit être effectuée avec les soins institutionnels appropriés et l’approbation du Comité d’utilisation.

Remarque: Le protocole de purification plaquettaire est décrit dans un diagramme de flux de la figure 1.

1. prélèvement de sang

1. Ajouter 25 μL de citrate de sodium à 3,2% (pH 7,2) en tant qu’anti-coagulant et 0,4 mM de Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) dans un tube en polypropylène.
2. Prélever environ 200 μL de sang de la souris C57BL/6 à l’aide d’un saignement rétroorbital.
   Remarque: le sang peut être recuei....

Results

Le résumé de la purification plaquettaire est décrit dans un diagramme de flux (figure 1). Les étapes comprennent la collecte de sang de la souris en utilisant des saignements rétroorbitaux en présence d’un anticoagulant, addition d’échantillon sanguin sur le milieu gradient Iohexol, centrifugation dans un rotor de godet oscillant à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c. La qualité des plaquettes purifiées a été évaluée avec la microscopie et la cytométrie en flux après coloration avec an.......

Discussion

Communément, les plaquettes sont isolées par centrifugation à basse vitesse qui donne un plasma riche en plaquettes qui contient un nombre significatif de cellules sanguines, de débris cellulaires et de protéines plasmatiques qui peuvent interférer avec les essais biochimiques et physiologiques et les besoins purification ultérieure²¹. Par conséquent, il est important d’utiliser une méthode rapide et simple qui peut produire des plaquettes pures sans contaminants majeurs. Le protocole présenté ici.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC rat anti-souris/humain CD62P (P-selectin)	Thermoscientific	17-0626-82	Marqueur d’activation plaquettaire Tube
d’Eppendorf	Fisher Scientific	14-222-166	Tube pour centifuge
FACS DIVA software	BD Biosciences	Article hors catalogue	Analyse des plaquettes et du sang total
Tube FACS	Fisher Scientific	352008	Tubes pour l’écoulement cytométrie
Sérum fœtal bovin (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingrédient pour tampon de coloration
FITC rat anti-souris CD41	BD Biosciences	553848	Marqueur plaquettaire
Cytomètre de flux	BD Biosciences	Article hors catalogue	Analyse des plaquettes et du sang total
Logiciel FlowJo FlowJo	, Inc.	Article hors-catalogue	Analyse des plaquettes et du sang total
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Prévenir la formation de caillots plaquettaires
Hématocrite Tube capillaire	Fisher Scientific	22-362566	Prélèvement sanguin Tube capillaire
Hemavet	Drew Scientific	Article non catalogue Analyseur	cellules sanguines
Hémocytomètre	Hausser Scientific	3100	Chambre de comptage cellulaire
Isoflurane	Baxter	1001936040	Utilisation pour anesthésier la souris
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Article hors catalogue	Surveillance et comptage cellulaires
Nycodenz (Histodenz)	Sigma-Aldrich	D2158	Gradient
medium PE rat anti-souris CD45	BD Biosciences	561087	marqueur WBC
PE-Cy7 rat anti-souris TER 119	BD Biosciences	557853	Marqueur RBC
Pointes de pipette 200 µ ; L, alésage large	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transfert d’échantillons de sang et de plaquettes
Embouts de pipette 1000 µ ; L, alésage large	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transfert d’échantillons de sang et de plaquettes
Saline au phosphate (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Tampon pour le lavage et la dilution
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich	S7653	Solution saline physiologique
Citrate de sodium	Fisher Scientific	02-688-26	Anticoagulant
Tampon de coloration	Interne	Article hors catalogue	Tampon de lavage et de dilution
Eau Steile		Interne Article hors catalogue	Solvant
Centrifugeuse de table ThermoFisher	Scientific	75253839/433607	Centrifugeuse à rotor à godet oscillant
Thrombin	Enzyme Research Laboratoty	HT 1002a	Agoniste de l’activation plaquettaire
Tricine	Tampon Sigma-Aldrich	T0377	pour support Nycodenz