स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटान में एक उच्च आण्विक द्रव्यमान प्रोटीन की शुद्धि
Summary
यहाँ वर्णित स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटानमें जीन उत्पाद की शुद्धि के लिए एक सरल विधि है . इस तकनीक प्रोटीन की शुद्धि में फायदेमंद हो सकता है, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन और उच्च आणविक बड़े पैमाने पर प्रोटीन, और विभिन्न अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
एक जीन के समारोह के स्पष्टीकरण आम तौर पर जंगली प्रकार उपभेदों और उपभेदों जिसमें ब्याज के जीन बाधित किया गया है के phenotypic लक्षण की तुलना शामिल है. जीन व्यवधान के बाद कार्य की हानि बाद में बाधित जीन के उत्पाद के बहिर्जात योग द्वारा बहाल की जाती है। यह जीन के कार्य को निर्धारित करने में मदद करता है। एक विधि पहले वर्णित एक gtfC जीन-विघटित Streptococus mutans तनाव पैदा करना शामिल है. यहाँ, एक unmanding विधि जीन व्यवधान के बाद नव उत्पन्न एस mutans तनाव से gtfC जीन उत्पाद को शुद्ध करने के लिए वर्णित है. यह ब्याज की जीन के 3 “अंत में एक polyhistidine-कोडिंग अनुक्रम के अलावा शामिल है, जो स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग जीन उत्पाद के सरल शुद्धि की अनुमति देता है. पीसीआर के अलावा कोई एंजाइमी प्रतिक्रियाओं इस विधि में आनुवंशिक संशोधन के लिए आवश्यक हैं। जीन विघटन के बाद exogenous इसके अलावा द्वारा जीन उत्पाद की बहाली जीन समारोह है, जो भी विभिन्न प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए एक कुशल तरीका है.
Introduction
एक जीन के समारोह के विश्लेषण आमतौर पर जिसमें ब्याज के जीन बाधित किया गया है उपभेदों के लिए जंगली प्रकार उपभेदों के phenotypic लक्षण की तुलना शामिल है. एक बार जीन-विक्षिंघरित तनाव का उत्पादन किया जाता है, जीन उत्पाद के exogenous इसके अलावा कार्यात्मक बहाली की अनुमति देता है.
बाद में बहाली परख के लिए आवश्यक शुद्ध जीन उत्पादों को प्राप्त करने के लिए सबसे आम तरीका एस्चेरीचिया कोली1में हेटेरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रदर्शन करना है . हालांकि, झिल्ली प्रोटीन या उच्च आणविक द्रव्यमान प्रोटीन की अभिव्यक्ति अक्सर इस प्रणाली1का उपयोग कर मुश्किल है. इन मामलों में, लक्ष्य प्रोटीन आमतौर पर कोशिकाओं है कि natively कदम है, जो जीन उत्पाद के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की एक जटिल श्रृंखला के माध्यम से प्रोटीन संश्लेषित से अलग है. इन मुद्दों को दूर करने के लिए, एक सरल प्रक्रिया जीन व्यवधान विधि के बाद जीन उत्पाद शुद्धिकरण के लिए विकसित किया गया है2, पीसीआर आधारित डीएनए splicing विधि3 (नामित दो कदम संलयन पीसीआर), और आनुवंशिक के लिए electroporation स्ट्रेप्टोकॉकस म्यूटमेंसमें रूपांतरण | जीन उत्पाद के सी-टर्मिनस में पॉलीहिसिडीन टैग (उसका टैग) के अलावा धातु संबंध क्रोमैटोग्राफी (आईएमए) द्वारा अपनी शुद्धि की सुविधा प्रदान करता है।
उनके टैग-expressing तनाव को अलग करने के लिए, ब्याज की जीन के पूरे जीनोमिक डीएनए (इस अपने टैग में-विघ्वित जीन-विघनी तनाव) एक एंटीबायोटिक प्रतिरोधी मार्कर जीन के साथ बदल दिया है. उनके टैग-अपशसन तनाव उत्पन्न करने की प्रक्रिया लगभग एक जीन-विघनी विकृति उत्पन्न करने के समान है जैसा कि पहले वर्णित4,5. इसलिए, जीन व्यवधान और जीन उत्पाद अलगाव के लिए तरीकों कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सीरियल प्रयोगों के रूप में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
वर्तमान कार्य में, एक polyhistidine-कोडिंग अनुक्रम gtfC के 3 “अंत से जुड़ा हुआ है (GenBank टिड्डी टैग SMU $1005) जीन, एन्कोडिंग glucosyltransferase-SI (GTF-SI) S. mutans6में . फिर, एक स्ट्रेप्टोकोकल प्रजातियों में अभिव्यक्ति अध्ययन प्रदर्शन किया गया. ई. कोलाई द्वारा विषमजीवी gtfC अभिव्यक्ति प्राप्त करना मुश्किल है, GTF-SI के उच्च आणविक द्रव्यमान के कारण होने की संभावना है। इस विकृति का नाम एस मटान उनका-gtfC है। एक योजनाबद्ध चित्रण gtfC और spectinomycin प्रतिरोध जीन कैसेट के संगठन का चित्रण (एसपीसीआर)7 वाइल्ड-टाइप एस mutans में loci (एस mutans WT) और उसके डेरिवेटिव में दिखाया गया है चित्र 1| GTF-SI एक स्रावी प्रोटीन है कि कैरिओजेनिक दंत बायोफिल्म6के विकास के लिए योगदान देता है। सुक्रोज की उपस्थिति में डब्ल्यूटी एस म्यूटन्स स्ट्रेन में कांच की चिकनी सतह पर एक अनुशीलन बायोफिल्म देखी जाती है, लेकिन एस म्यूटन्स जीटीएफसीमें नहीं – बाधित तनाव (एस. म्यूटन्स ]gtfC)2,5 . बायोफिल्म गठन एस mutans में बहाल किया जाता है –जी.टी.एफ.सी. पुनः संयोजक GTF-SI के exogenous इसके अलावा पर. तनाव, एस mutans उसकीgtfC,तो पुनः संयोजक GTF-SI का उत्पादन करने के लिए प्रयोग किया जाताहै.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राइमर के डिजाइन प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है. gtfC-रिवर्स और एसपीसीआर-फॉरवर्डप्राइमर के अनुक्रम ों का निर्धारण gtfC के 3 के अंत क्षेत्र और एसपीसीआरके 5 के अंत क्षेत्र दोनों क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) (संख्या 16K15860 और 19K10471 टी एम, 17K12032 से एम.आई., और 18K09926 एन एच) और SECOM विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन (SECOM) (अनुदान 2018.00) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
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