نقل العدلات المرتبطة بالورم إلى الفئران الحاملة للورم لدراسة إمكاناتها الوعائية في الجسم الحي
Summary
هنا، نعرض الإمكانات العلاجية للالعدلات المضادة للأوعية المرتبطة بالورم بعد نقلها إلى الفئران الحاملة للورم. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتعامل مع نشاط العدلات في الجسم الحي السابق ولتقييم وظائفها في الجسم الحي في تطوير الأورام. وهو نموذج مناسب لدراسة العلاجات المناعية المحتملة القائمة على العدلات.
Abstract
مساهمة العدلات في تنظيم تكوين الأورام هو الحصول على مزيد من الاهتمام. هذه الخلايا غير متجانسة، واعتمادا على محيط الورم يمكن أن تمتلك القدرة المؤيدة أو المضادة للورم. واحدة من السيتوكينات الهامة التي تنظم وظائف العدلات في سياق الورم هي نوع I الإنترفيرون. في وجود الإنترفيرون، العدلات اكتساب خصائص مضادة للورم، بما في ذلك السمية الخلوية أو تحفيز الجهاز المناعي. وعلى العكس من ذلك، يؤدي عدم وجود إشارة الإنترفيرون إلى نشاط بارز مؤيد للورم، يتميز بالتحفيز القوي لتكوين الأوعية الدموية الورمي. في الآونة الأخيرة، يمكننا أن نثبت أن الخصائص المؤيدة للأوعية الدموية من العدلات تعتمد على تنشيط النيوتيناميد فوسفوريبوسيلترانسفيراز (NAMPT) إشارة المسار في هذه الخلايا. تثبيط هذا المسار في العدلات المرتبطة بالورم يؤدي إلى النمط الظاهري المضاد للأوعية الدموية قوية. هنا، نقوم بإظهار نموذجنا المنشأ حديثاً الذي يسمح في تقييم الجسم الحي للإمكانات الورمية للالعدلات المرتبطة بالأورام (TANs). قريبا، يمكن عزل العدلات المرتبطة بالأورام المؤيدة للأوعية من الفئران التي تعاني من نقص الإنترفيرون ويعاد استقطابها إلى النمط الظاهري المضاد للأوعية من خلال حجب إشارات NAMPT. ويمكن تقييم النشاط الوعائي لهذه الخلايا في وقت لاحق باستخدام فحص حلقة الأبهر. يمكن نقل TANs المضادة للأوعية إلى متلقي النوع البري الحامل للورم وينبغي مراقبة نمو الورم لمدة 14 يوما. في اليوم 14 يتم التضحية الفئران، وإزالة الأورام وقطع مع تقييم الأوعية الدموية الخاصة بهم. بشكل عام، يوفر بروتوكولنا أداة جديدة لتقييم القدرة الوعائية للخلايا الأولية في الجسم الحي، مثل العدلات المرتبطة بالورم، دون الحاجة إلى استخدام نماذج خط الخلايا الاصطناعية في العدلات. Vc
Introduction
النوع الأول الإنترفيرون (IFNs) تلعب دورا هاما في تحفيز ردود المضيف على الأورام، كما أن عدم وجود نوع I IFN إشارات النتائج في ارتفاع كبير في نمو الورم1. واحدة من الآليات المشاركة في هذه العملية هو تنظيم النشاط الورمي من العدلات المرتبطة بالورم، والتي يتم التحكم فيها من قبل مستعمرة تحفيز عامل 3 مستقبلات (CSF3R) المصب إشارة2. وقد تبين أن عامل تحفيز المستعمرة 3 (CSF3)، أو عامل تحفيز مستعمرة المحببات، لتنشيط الإشارات التي تنطوي على نيكوتيناميد فوسفوريبوسيلترانسفيراز (NAMPT)3،4. NAMPT هو إنزيم الحد من معدل لتوليف الأدينين الدينوكليوتيد نيكوتيناميد, الذي يعزز تحلل الدم وتنظيم إصلاح الحمض النووي, التعبير الجيني, واستجابة الإجهاد تعزيز الخلايا السرطانية البقاء على قيد الحياة وانتشار5. يتم الإفراط في NAMPT في أنواع السرطان متعددة، بما في ذلك القولونوالمستقيم، المبيض، الثدي، المعدة، سرطان البروستاتا والأورام الدبقية 6. NAMPT ضروري ليس فقط للخلايا السرطانية، ولكن أيضا لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في الأورام، مثل الخلايا النخاعية – فإنه يدفع تمايزها4،ويمنع المبرمج وتحفيز التعبير عن السيتوكينات متعددة أو مصفوفة الانزيمات المهينة في الضامة7.
يمثل العدلات المرتبطة بالورم المغيرين اتلاف نمو الورم. وظائف تان تعتمد بشدة على توافر نوع IIFN، وهذه السيتوكينات الرئيسية النشاط المضادة للورم من العدلات. على العكس من ذلك، فإن غياب IFNs يدعم تنشيط الورم من هذه الخلايا، وخاصة خصائصها المؤيدة للأوعية الدموية. وبالاتفاق مع ذلك، فإن الفئران التي تعاني من نقص في الشبكات الدولية للأمراض تتطور إلى أورام الأوعية الدموية الأكبر بشكل كبير وأفضل، والتي يتم اختراقها بقوة مع العدلات المؤيدة للأورام/المؤيدة للأوعية الدموية1،2،8، 9،10. والأهم من ذلك، أن هذه النفثالينات المضادة للأوعية تظهر نشاطًا مرتفعًا من NAMPT، مما يشير إلى دورها الأساسي في استقطاب العدلات المؤيد للورم.
استنفاد العدلات باستخدام الأجسام المضادة Ly6G أو تثبيط هجرتهم (CXCR2 الأجسام المضادة) يؤدي إلى انخفاض تكوين الأوعية الدموية الورم, النمو, والنقيل1,8. ومع ذلك, ولدت الأجسام المضادة أحادية النسيلة هي المناعية, ويرتبط إدارتها مع مجموعة من الآثار الجانبية التي تهدد الحياة11. العلاج مع جزيئات صغيرة، مثل مثبطات NAMPT FK866، أن تعدل الورم العدلات، يمكن أن تساعد على تجنب مثل هذه المضاعفات. لسوء الحظ, تثبيط الجهازية الدوائية من NAMPT, بجانب تأثيرها العلاجي على نمو الورم, يؤدي إلى آثار جانبية شديدة بما في ذلك سمية الجهاز الهضمي ونقص الصفيحات. ولذلك، فإن التطبيق المنهجي لمثبطات NAMPT غير ممكن12،13،14.
ولهذا السبب، نقترح هنا بروتوكولاً يتم فيه حظر نشاط حركة عدم الانحياز مباشرة في شبكات الاتصال المحلية المعزولة. ثم يتم نقل هذه العدلات المضادة للورم بالتبني إلى مضيف تحمل الورم. وسيساعد هذا البروتوكول على تجنب الآثار الجانبية السمية النظامية للمركبات، في حين أن تأثيره على الخلايا المستهدفة سيستمر.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من التقدم المحرز في علاج السرطان الجراحي والدوائي، لا يزال العلاج الناجح يشكل تحديا. وبما أن الخلايا المناعية معروفة بلعب دور هام في تنظيم نمو الورم، ينبغي إنشاء أساليب جديدة تمنع الورم في هذه الخلايا. هنا نبرهن على نهج جديد لقمع نمو الورم عن طريق نقل بالتبني من العدلات المضادة ل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم عملنا بمنح من دويتشه كريبسيليف، رقم المنحة: 111647، ومجلس البحوث الألماني (DFG)، رقم المنحة: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -. F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Recherche en cancérologie. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
