Overførsel af manipulerede tumor-associerede neutrofiler til tumor bærende mus for at studere deres angiogene potentiale in vivo
Summary
Her viser vi terapeutisk potentiale af anti-angiogen tumor-associerede neutrofiler efter deres overførsel til tumor bærende mus. Denne protokol kan bruges til at manipulere neutrofilaktiviteten ex vivo og til efterfølgende at evaluere deres funktionalitet in vivo i udviklingen af tumorer. Det er en hensigtsmæssig model til at studere potentielle neutrofilbaserede immunterapier.
Abstract
Bidraget af neutrofiler til reguleringen af tumor bliver øget opmærksomhed. Disse celler er heterogene, og afhængigt af tumor Milieu kan besidde Pro-eller anti-tumor kapacitet. En af de vigtige cytokiner regulere neutrofile funktioner i en tumor sammenhæng er type I Interferoner. I nærværelse af Interferoner, neutrofiler få anti-tumor egenskaber, herunder cytotoksicitet eller stimulering af immunsystemet. Omvendt, fraværet af et interferon signalering resulterer i fremtrædende Pro-tumor aktivitet, karakteriseret med stærk stimulering af tumor angiogenese. For nylig kunne vi påvise, at proangiogene egenskaber af neutrofiler afhænger af aktivering af nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) signalering pathway i disse celler. Hæmning af denne vej i tumor-associerede neutrofiler fører til deres potente anti-angiogen fænotype. Her viser vi vores nyetablerede model giver in vivo evaluering af tumorigent potentiale manipulerede tumor-associerede neutrofiler (tans). Kort, Pro-angiogen tumor-associerede neutrofiler kan isoleres fra tumor-bærende interferon-mangelfulde mus og repolariseret i anti-angiogen fænotype ved blokering af NAMPT signalering. Den angiogene aktivitet af disse celler kan efterfølgende evalueres ved hjælp af en aorta ringanalyse. Anti-angiogen TANs kan overføres til tumor-bærende vilde type modtagere og tumorvækst bør overvåges for 14 dage. På dag 14 mus er ofret, tumorer fjernet og skåret med deres vaskularisering vurderes. Samlet set, vores protokol giver et nyt værktøj til in vivo evaluere angiogen kapacitet af primære celler, såsom tumor-associerede neutrofiler, uden behov for at bruge kunstige neutrofilcellellinie modeller. Vc
Introduction
Type I Interferoner (IFNs) spiller en vigtig rolle i stimuleringen af vært svar til neoplasias, som manglen på type I IFN signalering resulterer i signifikant forhøjet tumorvækst1. En af de mekanismer, der er involveret i denne proces er reguleringen af tumorigent aktivitet af tumor-associerede neutrofiler, som styres af kolonistimulerende faktor 3 receptor (CSF3R) downstream signalering2. Kolonistimulerende faktor 3 (CSF3) eller granulocytkoloni stimulerende faktor, viste sig at aktivere signalering, der involverer nicotinamid phosphoribosyltransferase (nampt)3,4. NAMPT er et sats-begrænsende enzym for nicotinamid adenin dinucleotid syntese, som forbedrer glykolyse og regulerer DNA reparation, genekspression, og stress respons fremme kræftceller overlevelse og spredning5. Nampt er overudtrykt i flere kræfttyper, herunder kolorektal, æggestokkene, bryst, gastrisk, prostatakræft og gliomer6. NAMPT er afgørende ikke kun for tumorceller, men også for en bred vifte af andre celletyper, der er til stede i tumorer, såsom myeloide celler-det driver deres differentiering4, hæmmer apoptose og stimulere ekspression af flere cytokiner eller matrix-nedbrydende enzymer i makrofager7.
Tumor-associerede neutrofiler repræsenterer vigtige modulatorer af tumorvækst. TAN funktioner er stærkt afhængige af typen jeg IFN tilgængelighed, som disse cytokiner Prime anti-tumor aktivitet af neutrofiler. Tværtimod, fraværet af ifns understøtter tumorigent aktivering af disse celler, især deres Pro-angiogen egenskaber. Efter aftale med dette, mus mangelfuld i ifns udvikle betydeligt større og bedre vaskulariserede tumorer, som er stærkt infiltreret med Pro-tumoral/Pro-angiogen neutrofiler1,2,8, 9,10. Vigtigere, sådanne Pro-angiogen TANs viser forhøjet aktivitet af NAMPT, tyder sin væsentlige rolle i Pro-tumor polarisering af neutrofiler.
Nedbrydning af neutrofiler ved hjælp af Ly6G antistof eller hæmning af deres migration (CXCR2 antistof) resulterer i nedsat tumor angiogenesis, vækst, og metastase1,8. Ikke desto mindre er genererede monoklonale antistoffer immunogene, og deres administration er forbundet med en række livstruende bivirkninger11. Behandling med små molekyler, såsom NAMPT inhibitor FK866, at moduere neutrofile tumoriogenicitet, kunne bidrage til at undgå sådanne komplikationer. Desværre, farmakologisk systemisk hæmning af NAMPT, ved siden af sin terapeutiske virkning på tumorvækst, fører til alvorlige bivirkninger, herunder gastrointestinal toksicitet og trombocytopeni. Derfor er den systemiske anvendelse af nampt-hæmmere ikke gennemførlig12,13,14.
Af denne grund, foreslår vi her en protokol, hvor NAMPT aktivitet er blokeret direkte i isolerede Tanger. Sådanne anti-tumor neutrofiler er derefter adoptivt overføres til en tumor-bærende vært. Denne protokol vil hjælpe med at undgå systemiske toksiske bivirkninger af forbindelserne, mens dens virkning på målcellerne vil blive opretholdt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trods fremskridt i kirurgisk og farmakologisk kræftbehandling, vellykket behandling er fortsat en udfordring. Da immunceller er kendt for at spille en vigtig rolle i reguleringen af tumorvækst, bør der etableres nye metoder til at hæmme tumorigenicitet af sådanne celler. Her viser vi en ny tilgang til at undertrykke tumorvækst via adoptiv overførsel af anti-angiogen tumor-associerede neutrofiler. Selektiv målretning af Pro-angiogen NAMPT signalering i TANs, ved hjælp af FK866 inhibitor, forhindrer bivirkninger, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vores arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Krebshilfe, Tilskudsnummer: 111647 og det tyske Forskningsråd (DFG), Tilskudsnummer: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -. F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Recherche en cancérologie. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
