Overdracht van gemanipuleerde tumor-geassocieerde neutrofielen in tumor-dragende muizen om hun angiogene potentiaal in vivo te bestuderen
Summary
Hier tonen we therapeutisch potentieel van Anti-angiogene tumor-geassocieerde neutrofielen na hun overdracht in tumor-dragende muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de neutrofiele activiteit ex vivo te manipuleren en vervolgens hun functionaliteit in vivo te evalueren bij het ontwikkelen van tumoren. Het is een geschikt model voor het bestuderen van potentiële op neutrofielen gebaseerde immunotherapieën.
Abstract
De bijdrage van neutrofielen aan de regulering van de tumorigenese wordt steeds meer aandacht. Deze cellen zijn heterogeen, en afhankelijk van de tumor milieu kan bezitten Pro-of anti-tumor capaciteit. Een van de belangrijke cytokines die neutrofiele functies reguleren in een tumor context zijn type I interferonen. In aanwezigheid van interferonen krijgen neutrofielen anti-tumor eigenschappen, waaronder cytotoxiciteit of stimulatie van het immuunsysteem. Omgekeerd, de afwezigheid van een interferon-signalering resulteert in prominente Pro-tumor activiteit, gekenmerkt door sterke stimulatie van tumor angiogenese. Onlangs konden we aantonen dat Pro-angiogene eigenschappen van neutrofielen afhangen van de activering van de signalering van Nicotinamide foshoribosyltransferase (NAMPT) in deze cellen. Remming van dit traject in tumor-geassocieerde neutrofielen leidt tot hun krachtige Anti-angiogene fenotype. Hier, we demonstreren onze nieuw opgerichte model waardoor in vivo evaluatie van tumorigene potentieel van gemanipuleerde tumor-geassocieerde neutrofielen (Tans). Kort, Pro-angiogene tumor-geassocieerde neutrofielen kunnen worden geïsoleerd van tumor-dragende interferon-deficiënte muizen en geherpolariseerd in anti-angiogenic fenotype door het blokkeren van NAMPT signalering. De angiogene activiteit van deze cellen kan vervolgens worden geëvalueerd met behulp van een aorta ringtest. Anti-angiogene TANs kunnen worden overgebracht in tumor-dragende wilde type ontvangers en tumorgroei moet worden gecontroleerd voor 14 dagen. Op dag 14 worden muizen opgeofferd, tumoren verwijderd en gesneden met hun vascularisatie beoordeeld. Over het algemeen biedt ons protocol een nieuw hulpmiddel om in vivo de angiogene capaciteit van primaire cellen te evalueren, zoals tumor-geassocieerde neutrofielen, zonder dat er gebruik moet worden maken van kunstmatige neutrofiele cellenlijn modellen. Vc
Introduction
Type I interferonen (IFNs) spelen een belangrijke rol bij het stimuleren van gastheer reacties op neoplasias, als het ontbreken van type I IFN signalering resulteert in significant verhoogde tumorgroei1. Een van de mechanismen die betrokken zijn bij dit proces is de regulering van de tumorigene activiteit van tumor-geassocieerde neutrofielen, die wordt gecontroleerd door kolonie-stimulerende factor 3 receptor (CSF3R) downstream signalering2. Kolonie-stimulerende factor 3 (CSF3), of granulocyt kolonie-stimulerende factor, werd aangetoond dat het activeren van signalering met betrekking tot Nicotinamide foshoribosyltransferase (nampt)3,4. NAMPT is een snelheidsbegrenzer enzym voor de synthese van Nicotinamide adenine dinucleotide, dat de glycolyse verbetert en de DNA-herstelling, genexpressie en stressrespons bevordert die kankercellen overleven en proliferatie5. Nampt wordt overuitgedrukt in meerdere soorten kanker, waaronder colorectale, ovariële, borst, maag, prostaatkanker en gliomen6. NAMPT is niet alleen essentieel voor tumorcellen, maar ook voor een breed scala aan andere celtypen die aanwezig zijn in tumoren, zoals myeloïde cellen-het drijft hun differentiatie4, remt apoptosis en stimuleren van expressie van meerdere cytokines of matrix-vernederende enzymen in macrofagen7.
Tumor-geassocieerde neutrofielen vertegenwoordigen belangrijke modulatoren van tumorgroei. TAN-functies zijn sterk afhankelijk van de beschikbaarheid van type I IFN, zoals deze cytokines Prime anti-tumor activiteit van neutrofielen. Integendeel, de afwezigheid van IFNs ondersteunt tumorigene activering van deze cellen, met name hun Pro-angiogenic eigenschappen. In overeenstemming met deze, muizen tekort aan IFNs ontwikkelen aanzienlijk grotere en betere gevasculariseerde tumoren, die sterk zijn geïnfiltreerd met Pro-tumoral/Pro-angiogene neutrofielen1,2,8, 9,10. Belangrijk is dat dergelijke Pro-angiogene TANs een verhoogde activiteit van NAMPT vertonen, wat haar essentiële rol in de Pro-tumor-polarisatie van neutrofielen suggereert.
Depletie van neutrofielen met behulp van Ly6G antilichaam of remming van hun migratie (CXCR2 antilichaam) resulteert in verminderde tumor angiogenese, groei, en metastase1,8. Niettemin, gegenereerde monoklonale antilichamen zijn immunogeen, en hun administratie wordt geassocieerd met een scala aan levensbedreigende bijwerkingen11. Behandeling met kleine moleculen, zoals NAMPT-remmer FK866, die de neutrofiele tumoriogeniciteit moduleren, kan dergelijke complicaties helpen voorkomen. Helaas, farmacologische systemische remming van NAMPT, naast het therapeutische effect op tumorgroei, leidt tot ernstige bijwerkingen met inbegrip van gastro-intestinale toxiciteit en trombocytopenie. Daarom is de systemische toepassing van nampt-remmers niet haalbaar12,13,14.
Daarom stellen we hier een protocol voor waarbij NAMPT-activiteit direct in geïsoleerde TANs wordt geblokkeerd. Dergelijke anti-tumor neutrofielen worden vervolgens adoptively overgebracht naar een tumor-dragende gastheer. Dit protocol zal helpen voorkomen dat systemische toxische neveneffecten van de verbindingen, terwijl het effect ervan op de doelcellen zal worden gehandhaafd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks de vooruitgang in chirurgische en farmacologische kankerbehandeling blijft succesvolle therapie een uitdaging. Aangezien immuun cellen zijn bekend dat een belangrijke rol spelen in de regulering van de tumorgroei, nieuwe methoden remming van de tumorigeniciteit van dergelijke cellen moeten worden vastgesteld. Hier demonstreren we een nieuwe aanpak om tumorgroei te onderdrukken via adoptie overdracht van Anti-angiogene tumor-geassocieerde neutrofielen. Selectieve targeting van Pro-angiogene NAMPT signalering in TA…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ons werk werd gesteund door subsidies van Deutsche Krebshilfe, subsidie nummer: 111647, en Duitse Onderzoeksraad (DFG), subsidie nummer: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -. F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Recherche en cancérologie. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
