Transfert de neutrophiles tumoraux manipulés dans des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique In Vivo
Summary
Ici, nous montrons le potentiel thérapeutique des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic après leur transfert dans les souris tumeur-portantes. Ce protocole peut être utilisé pour manipuler l’activité neutrophile ex vivo et pour ensuite évaluer leur fonctionnalité in vivo dans le développement de tumeurs. Il s’agit d’un modèle approprié pour l’étude des immunothérapies potentielles à base de neutrophiles.
Abstract
La contribution des neutrophiles à la régulation de la tumorigénèse reçoit une attention accrue. Ces cellules sont hétérogènes, et selon le milieu tumoral peut posséder une capacité pro- ou anti-tumorale. Une des cytokines importantes régulant des fonctions de neutrophile dans un contexte de tumeur sont des interférons de type I. En présence d’interférons, les neutrophiles gagnent des propriétés antitumorales, y compris la cytotoxicité ou la stimulation du système immunitaire. Inversement, l’absence d’un signal d’interféron a comme conséquence l’activité pro-tumorale pro en avant, caractérisée avec la stimulation forte de l’angiogenèse de tumeur. Récemment, nous pourrions démontrer que les propriétés pro-angiogéniques des neutrophiles dépendent de l’activation de la voie de signalisation de phosphoribosyltransferase de nicotinamide (NAMPT) dans ces cellules. L’inhibition de cette voie dans les neutrophiles tumeur-associés mène à leur phénotype anti-angiogenic puissant. Ici, nous démontrons notre modèle nouvellement établi permettant l’évaluation in vivo du potentiel tumorigenic des neutrophiles tumoraux-associés manipulés (TANs). Peu de temps après, les neutrophiles tumeur-associés pro-angiogenic peuvent être isolés des souris interféron-déficientes de tumeur-portantes et repolarized dans le phénotype anti-angiogenic en bloquant la signalisation de NAMPT. L’activité angiogénique de ces cellules peut être ensuite évaluée à l’aide d’un analyse de l’anneau aortique. Les TAN anti-angiogéniques peuvent être transférés dans les destinataires sauvages de type tumeur-portant s’ils portent et la croissance de tumeur devrait être surveillée pendant 14 jours. Au jour 14 souris sont sacrifiées, tumeurs enlevées et coupées avec leur vascularisation évaluée. Dans l’ensemble, notre protocole fournit un nouvel outil pour évaluer in vivo la capacité angiogénique des cellules primaires, telles que les neutrophiles tumeur-associés, sans avoir besoin d’employer des modèles artificiels de ligne de cellules de neutrophile. Vc
Introduction
Les interférons de type I (IFN) jouent un rôle important dans la stimulation des réponses de l’hôte aux néoplasias, car l’absence de signalisation IFN de type I entraîne une croissance tumorale significativement élevée1. Un des mécanismes impliqués dans ce processus est la régulation de l’activité tumorigène des neutrophiles tumeur-associés, qui estcontrôlé par le récepteur de facteur 3 de colonie-stimulant (CSF3R) en aval signalant 2. Le facteur de stimulation de la colonie 3 (CSF3), ou facteur stimulant la colonie de granulocytes, a été montré pour activer la signalisation impliquant le phosphoribosyltransferase de nicotinamide (NAMPT)3,4. NAMPT est une enzyme limitant le taux pour la synthèse de dinuccléotide d’adénine de nicotinamide, qui améliore la glycolyse et régule la réparation d’ADN, l’expression de gène, et la réponse de stress favorisant la survie et la proliférationdecellules cancéreuses 5. Le NAMPT est surexprimé dans plusieurs types de cancer, y compris colorectal, ovaire, sein, gastrique, cancer de la prostate et gliomes6. NAMPT est essentiel non seulement pour les cellules tumorales, mais aussi pour une grande variété d’autres types de cellules qui sont présents dans les tumeurs, telles que les cellules myéloïdes – il conduit leur différenciation4, inhibe l’apoptose et stimuler l’expression de cytokines multiples ou enzymes dégradantes dans les macrophages7.
Les neutrophiles tumeur-associés représentent les modulateurs importants de la croissance de tumeur. Les fonctions TAN dépendent fortement de la disponibilité de type I IFN, car ces cytokines première activité antitumorale des neutrophiles. Au contraire, l’absence d’IFN soutient l’activation tumorigène de ces cellules, en particulier leurs propriétés pro-angiogéniques. En accord avec cela, les souris déficientes en IFN développent des tumeurs significativement plus grandes et mieux vascularisées, qui sont fortement infiltrées avec des neutrophiles pro-tumoral/pro-angiogéniques1,2,8, 9,10. Fait important, ces TAN pro-angiogéniques montrent une activité élevée de NAMPT, suggérant son rôle essentiel dans la polarisation pro-tumorale des neutrophiles.
L’épuisement des neutrophiles utilisant l’anticorps ly6G ou l’inhibition de leur migration (anticorps CXCR2) a comme conséquence l’angiogenèse diminuée de tumeur, la croissance, et la métastasie1,8. Néanmoins, les anticorps monoclonaux générés sont immunogènes, et leur administration est associée à une gamme d’effets secondaires représentant un danger pour la vie11. Le traitement avec de petites molécules, telles que l’inhibiteur de NAMPT FK866, qui modulent la tumoriogenicity de neutrophile, pourrait aider à éviter de telles complications. Malheureusement, l’inhibition systémique pharmacologique de NAMPT, à côté de son effet thérapeutique sur la croissance de tumeur, mène aux effets secondaires graves comprenant la toxicité gastro-intestinale et la thrombocytopenia. Par conséquent, l’application systémique des inhibiteurs nAMPT n’est pas faisable12,13,14.
Pour cette raison, nous suggérons ici un protocole où l’activité NAMPT est bloquée directement dans les NAN isolés. De tels neutrophiles antitumorales sont alors adoptifs transférés dans un hôte tumeur-portant. Ce protocole permettra d’éviter les effets secondaires toxiques systémiques des composés, tandis que son effet sur les cellules cibles sera maintenu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré les progrès dans le traitement chirurgical et pharmacologique du cancer, la thérapie réussie demeure un défi. Puisque les cellules immunitaires sont connues pour jouer un rôle important dans la régulation de la croissance de tumeur, de nouvelles méthodes inhibant la tumorigenicité de telles cellules devraient être établies. Ici nous démontrons une approche nouvelle pour supprimer la croissance de tumeur par l’intermédiaire du transfert adoptif des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic tumeur-a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Notre travail a été soutenu par des subventions de Deutsche Krebshilfe, Numéro de subvention: 111647, et German Research Council (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
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