Transfer von manipulierten Tumor-assoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse zur Untersuchung ihres angiogenen Potenzials in Vivo
Summary
Hier zeigen wir das therapeutische Potenzial antiangiogener Tumor-assoziierter Neutrophilen nach ihrer Übertragung in tumortragende Mäuse. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um neutrophile Aktivität ex vivo zu manipulieren und anschließend ihre Funktionalität in vivo bei der Entwicklungvon Tumoren zu bewerten. Es ist ein geeignetes Modell für die Untersuchung potenzieller neutrophiler Immuntherapien.
Abstract
Der Beitrag von Neutrophilen zur Regulierung der Tumorgenese wird immer mehr beachtet. Diese Zellen sind heterogen und können je nach Tumormilieu pro- oder antitumor-Kapazität besitzen. Eines der wichtigen Zytokine, die neutrophile Funktionen in einem Tumorkontext regulieren, sind Typ-I-Interferone. In Gegenwart von Interferonen, Neutrophile gewinnen Anti-Tumor-Eigenschaften, einschließlich Zytotoxizität oder Stimulation des Immunsystems. Umgekehrt führt das Fehlen einer Interferon-Signalisierung zu einer ausgeprägten Pro-Tumor-Aktivität, die durch eine starke Stimulation der Tumorangiogenese gekennzeichnet ist. Kürzlich konnten wir zeigen, dass pro-angiogene Eigenschaften von Neutrophilen von der Aktivierung von Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT) Signalweg in diesen Zellen abhängen. Die Hemmung dieses Weges bei tumorassoziierten Neutrophilen führt zu ihrem potenten antiangiogenen Phänotyp. Hier zeigen wir unser neu etabliertes Modell, das die In-vivo-Bewertung des tumorgenen Potenzials manipulierter tumorassoziierter Neutrophilen (TANs) ermöglicht. Kurz darauf können pro-angiogene tumorassoziierte Neutrophile von tumortragenden Interferon-Mäusen isoliert und durch Blockierung der NAMPT-Signalisierung zu antiangiogenem Phänotyp repolarisiert werden. Die angiogene Aktivität dieser Zellen kann anschließend mit einem Aortenring-Assay bewertet werden. Antiangiogene TANs können in tumortragende Wildtyp-Empfänger übertragen werden und das Tumorwachstum sollte 14 Tage lang überwacht werden. Am Tag werden 14 Mäuse geopfert, Tumore entfernt und mit ihrer Vaskularisation geschnitten. Insgesamt bietet unser Protokoll ein neuartiges Werkzeug zur In-vivo-Bewertung der angiogenen Kapazität von Primärzellen, wie tumorassoziierten Neutrophilen, ohne künstliche neutrophile Zelllinienmodelle verwenden zu müssen. Vc
Introduction
Typ-I-Interferone (IFNs) spielen eine wichtige Rolle bei der Stimulierung von Wirtsreaktionen auf Neoplasie, da der Mangel an Typ-I-IFN-Signalisierung zu einem signifikant erhöhten Tumorwachstum führt1. Einer der Mechanismen, die an diesem Prozess beteiligt sind, ist die Regulierung der tumorigenen Aktivität von tumorassoziierten Neutrophilen, die durch koloniestimulierenden Faktor 3-Rezeptor (CSF3R) nachgeschaltete Signalisierung2gesteuert wird. Der koloniestimulierende Faktor 3 (CSF3) oder granulozyten koloniestimulierender Faktor wurde gezeigt, dass die Signalisierung mit Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT) aktiviert wird3,4. NAMPT ist ein ratenbegrenzendes Enzym für die Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Synthese, das die Glykolyse verbessert und DNA-Reparatur, Genexpression und Stressreaktion reguliert, die das Überleben und die Proliferation von Krebszellen fördern5. NAMPT ist bei mehreren Krebsarten überexprimiert, einschließlich Dickdarm-, Eierstock-, Brust-, Magen-, Prostatakrebs- und Gliome6. NAMPT ist nicht nur für Tumorzellen wichtig, sondern auch für eine Vielzahl anderer Zelltypen, die in Tumoren vorhanden sind, wie z. B. myeloische Zellen – es treibt ihre Differenzierungan 4, hemmt die Apoptose und stimuliert die Expression mehrerer Zytokine oder Matrixabbauende Enzyme in Makrophagen7.
Tumorassoziierte Neutrophile stellen wichtige Modulatoren des Tumorwachstums dar. TAN-Funktionen sind stark abhängig von der Verfügbarkeit des Typs I IFN, da diese Zytokine die Antitumoraktivität von Neutrophilen prime. Im Gegenteil, das Fehlen von IFNs unterstützt die tumorgene Aktivierung dieser Zellen, insbesondere ihre pro-angiogenen Eigenschaften. In Übereinstimmung damit entwickeln Mäuse mit einem Mangel an IFNs signifikant größere und besser vaskularisierte Tumoren, die stark mit protumoralen/pro-angiogenen Neutrophilen infiltriert werden1,2,8, 9,10. Wichtig ist, dass solche pro-angiogenen TANs eine erhöhte Aktivität von NAMPT aufweisen, was auf seine wesentliche Rolle bei der Pro-Tumor-Polarisation von Neutrophilen hindeutet.
Die Erschöpfung von Neutrophilen mit Ly6G-Antikörpern oder Hemmung ihrer Migration (CXCR2-Antikörper) führt zu verminderter Tumorangiogenese, Wachstum und Metastasierung1,8. Dennoch sind erzeugte monoklonale Antikörper immunogen, und ihre Verabreichung ist mit einer Reihe von lebensbedrohlichen Nebenwirkungen verbunden11. Die Behandlung mit kleinen Molekülen, wie dem NAMPT-Hemmer FK866, der die neutrophile Tumoriogenität modulieren, könnte helfen, solche Komplikationen zu vermeiden. Leider, pharmakologische systemische Hemmung von NAMPT, neben seiner therapeutischen Wirkung auf das Tumorwachstum, führt zu schweren Nebenwirkungen einschließlich gastrointestinaler Toxizität und Thrombozytopenie. Daher ist die systemische Anwendung von NAMPT-Inhibitoren nicht möglich12,13,14.
Aus diesem Grund schlagen wir hier ein Protokoll vor, bei dem NAMPT-Aktivitäten direkt in isolierten TANs blockiert werden. Solche Anti-Tumor-Neutrophile werden dann adoptiv in einen tumortragenden Wirt übertragen. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, systemische toxische Nebenwirkungen der Verbindungen zu vermeiden, während seine Wirkung auf die Zielzellen erhalten bleibt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trotz der Fortschritte in der chirurgischen und pharmakologischen Krebsbehandlung bleibt eine erfolgreiche Therapie eine Herausforderung. Da Immunzellen bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Tumorwachstums spielen, sollten neuartige Methoden etabliert werden, die die Tumorigenizität solcher Zellen hemmen. Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Unterdrückung des Tumorwachstums durch Adoptivtransfer antiangiogenicer Tumor-assoziierter Neutrophile. Selektives Targeting der pro-angiogenen NAMPT-S…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt wurde unsere Arbeit durch Stipendien der Deutschen Krebshilfe, Fördernummer: 111647, und des Deutschen Forschungsrates (DFG), Fördernummer: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -. F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Recherche en cancérologie. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
