העברה של הגידול מניפולציות הקשורים נויטרופילים לתוך הגידול עכברים נושאת ללמוד פוטנציאל אנגיוגנטי שלהם ב Vivo
Summary
כאן, אנו מראים פוטנציאל טיפולי של אנטי-אנגיוגנטי הקשורים לגידול נויטרופילים לאחר העברתו לתוך עכברים נושאת הגידול. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לתמרן את פעילות נויטרופילים לשעבר vivo וכתוצאה מכך להעריך את הפונקציונליות שלהם ב vivo בפיתוח גידולים. זהו מודל מתאים ללימודי חיסוני פוטנציאלי מבוססי נויטרופילים.
Abstract
התרומה של נויטרופילים לוויסות של tuמוריגנזה הוא מקבל תשומת לב מוגברת. תאים אלה הם הטרוגנית, ובהתאם לסביבה הגידול יכול להכיל pro-או אנטי גידול קיבולת. אחד של ציטוקינים חשוב הוויסות פונקציות נויטרופילים בהקשר הגידול הם סוג אני הפרעות. בנוכחות של הפרעות, נויטרופילים לצבור תכונות נגד הגידול, כולל הרעלת ציטוקיות או גירוי של המערכת החיסונית. לעומת זאת, העדר אינטרפרון איתות תוצאות בולטים פעילות הגידול, המאופיינת גירוי חזק של אנגיוגנזה הגידול. לאחרונה, אנו יכולים להדגים את התכונות pro-אנגיוגנטי של נויטרופילים תלוי בהפעלה של ניטינאמיד פוספוריבבויואז (NAMPT) איתות בתאים אלה. עיכוב של מסלול זה הקשורים הגידול נויטרופילים מוביל שלהם פנוטיפים חזקים אנטי-אנגיוגנטיים. כאן, אנו להדגים את המודל החדש שלנו מאפשר הערכה vivo של הפוטנציאל הטוריגניים של מניפולציות הגידול משויך נויטרופילים (שיזוף). בתוך זמן קצר, pro-אנגיוגנטי הקשורים הגידול נויטרופילים יכול להיות מבודד מן הגידול הנושאת אינטרפרון-לקויה עכברים ולאחר לתוך הפנטיפים אנטי-אנגיוגנטיים על ידי חסימת של איתות NAMPT. הפעילות האנגיוגנטית של תאים אלה ניתן להעריך לאחר מכן באמצעות שיטת הטבעת של אבי העורקים. השיזוף אנטי-אנגיוגנטי יכול להיות מועבר לתוך הגידול הנושאת מקבלי סוג פראי הגידול צריך להיות מנוטרים עבור 14 ימים. ביום 14 עכברים הם הוקרב, גידולים הוסרו לחתוך עם vascularization שלהם מוערך. בסך הכל, הפרוטוקול שלנו מספק כלי הרומן של vivo הערכת יכולת אנגיוגנטית של תאים ראשוניים, כגון משויך הגידול נויטרופילים, ללא צורך להשתמש במודלים של תאים מלאכותיים נויטרופילים קו. vc
Introduction
הפרעות סוג I (IFNs) לשחק תפקיד חשוב גירוי של תגובות המארחים neoplasias, כמו חוסר סוג אני IFNS איתות תוצאות בצמיחה הגידול מוגבר באופן משמעותי1. אחד המנגנונים המעורבים בתהליך זה הוא הרגולציה של הפעילות הטומורגנית של הגידול, נויטרופילים הקשורים, אשר נשלט על ידי גורם המושבה מגרה 3 קולטן (CSF3R) במורד איתות2. המושבה-גורם מגרה 3 (CSF3), או מושבת גרנבייט גורם מגרה, הוכח להפעיל איתות מעורבים פוספוליאמיד זרחן (nampt)3,4. NAMPT הוא אנזים מגביל שיעור עבור הסינתזה של התיקון הניאודאמיד, אשר משפר את גליקולוליזיס ומווסת את תקן ה-DNA, ביטוי גנים, ותגובת מתח לקידום תאים סרטניים הישרדות והתפשטות5. NAMPT הוא מבוטא יתר על סוגי סרטן מרובים, כולל המעי הגס, השחלות, שד, קיבה, סרטן הערמונית gliomas6. NAMPT הוא חיוני לא רק עבור תאים סרטניים, אלא גם עבור מגוון רחב של סוגי תאים אחרים הנמצאים בגידולים, כגון תאים מיאלואיד-זה כוננים שלהם בידול4, מעכב אפופטוזיס ולעורר ביטוי של ציטוקינים מרובים או אנזימים משפילים מטריקס במקרופאגים7.
הגידול משויך נויטרופילים לייצג מאפטורים חשובים של צמיחת הגידול. פונקציות TAN תלויים מאוד הסוג I IFN זמינות, כמו אלה ציטוקינים הממשלה אנטי סרטניים הפעילות של נויטרופילים. להיפך, היעדר IFNs תומך בהפעלה הטוריגנית של תאים אלה, בעיקר תכונות pro-אנגיוגנטי שלהם. בהסכם עם זה, עכברים לקויה ב-ifns לפתח באופן משמעותי יותר ויותר גידולים vascularized אשר חדרו מאוד עם pro-tumoral/pro-אנגיוגנטי נויטרופילים1,2,8, 9,10. חשוב מכך, כגון שיזוף pro-אנגיוגנטי להראות פעילות מוגבה של NAMPT, מציע את תפקידה העיקרי בפולריזציה הגידול פרו של נויטרופילים.
דלדול של נויטרופילים באמצעות נוגדן Ly6G או עיכוב של הגירה שלהם (CXCR2 נוגדן) תוצאות מופחת אנגיוגנזה הגידול, צמיחה, גרורות1,8. עם זאת, נוגדנים חד-שבטיים שנוצרו הם חיסוני, והממשל שלהם משויך למגוון של תופעות לוואי סכנת חיים11. טיפול עם מולקולות קטנות, כגון NAMPT מעכבי FK866, כי לווסת נויטרופילים tumorio, יכול לעזור כדי למנוע סיבוכים כאלה. למרבה הצער, עיכוב תרופתי מערכתית של NAMPT, ליד ההשפעה הטיפולית שלה על גידול הגידול, מוביל לתופעות לוואי חמורות כולל רעילות מערכת העיכול ו תרומבוציטופניה. לכן, יישום מערכתית של מעכבי nampt אינו אפשרי12,13,14.
מסיבה זו, אנו מציעים כאן פרוטוקול בו הפעילות NAMPT חסומה ישירות בשיזוף מבודד. כגון אנטי הגידול נויטרופילים הם הועברו אז מאומצים לתוך מארח הנושאת גידול. פרוטוקול זה יסייע להימנע תופעות לוואי רעילות מערכתית של תרכובות, בעוד השפעתו על תאי היעד יהיה מתמשך.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות ההתקדמות בטיפול כירורגי ותרופתי בסרטן, טיפול מוצלח נשאר אתגר. מאז התאים החיסוניים ידועים לשחק תפקיד חשוב בוויסות צמיחת הגידול, שיטות הרומן מעכב tuמגנגניות של תאים כאלה יש להקים. כאן אנו מדגימים גישה הרומן לדכא את צמיחת הגידול באמצעות העברה המאמצת של אנטי-אנגיוגנטי הגידול משויך נויטר…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה שלנו נתמכת על ידי מענקים מחברת דויטשה קהרבשילוב, מספר גרנט: 111647, ומועצת המחקר הגרמנית (DFG), מספר גרנט: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -. F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Recherche en cancérologie. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
