विवो में अपने एंजियोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर-असरिंग चूहे में हेरफेर ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल का स्थानांतरण
Summary
यहां, हम ट्यूमर असर चूहों में उनके हस्तांतरण के बाद विरोधी एंजियोजेनिक ट्यूमर संबद्ध न्यूट्रोफिल की चिकित्सीय क्षमता दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग न्यूट्रोफिल गतिविधि पूर्व विवो में हेरफेर करने और बाद में ट्यूमर के विकास में विवो में उनकी कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है. यह संभावित न्यूट्रोफिल-आधारित इम्यूनोथेरपी का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल है।
Abstract
ट्यूमरजनन के विनियमन में न्यूट्रोफिल का योगदान बढ़ रहा है। इन कोशिकाओं विषम हैं, और ट्यूमर वातावरण के आधार पर समर्थक या विरोधी ट्यूमर क्षमता के अधिकारी कर सकते हैं. एक ट्यूमर संदर्भ में न्यूट्रोफिल कार्यों को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण साइटोकिन्स में से एक प्रकार मैं interferons हैं. इंटरफेरॉन की उपस्थिति में, न्यूट्रोफिल एंटी-ट्यूमर गुण प्राप्त करते हैं, जिसमें साइटोटॉक्सिसिटी या प्रतिरक्षा प्रणाली की उत्तेजना शामिल है। इसके विपरीत, प्रमुख समर्थक ट्यूमर गतिविधि में एक इंटरफेरॉन संकेतन परिणाम ों की अनुपस्थिति, ट्यूमर एंजियोजेनेसिस की मजबूत उत्तेजना के साथ विशेषता। हाल ही में, हम यह प्रदर्शित कर सकते हैं कि न्यूट्रोफिल के प्रो-एंजिोजेनिक गुण इन कोशिकाओं में निकोटिनमाइड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफरेज़ (एनएपीटी) संकेतन मार्ग के सक्रियण पर निर्भर करते हैं। ट्यूमर संबद्ध न्यूट्रोफिल में इस मार्ग का निषेध उनके शक्तिशाली विरोधी एंजियोजेनिक फीनोटाइप की ओर जाता है। यहाँ, हम हेरफेर ट्यूमर संबद्ध न्यूट्रोफिल (TANs) के tumorigenic क्षमता के vivo मूल्यांकन में अनुमति हमारे नव स्थापित मॉडल का प्रदर्शन. शीघ्र ही, प्रो-एंजियोजेनिक ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल ट्यूमर असर interferon कमी चूहों से अलग किया जा सकता है और NAMPT संकेतन के अवरुद्ध द्वारा विरोधी एंजियोजेनिक phenotype में repolarized. इन कोशिकाओं की एंजियोजेनिक गतिविधि बाद में एक महाधमनी अंगूठी परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. एंटी-एंजियोजेनिक टैन्स को ट्यूमर असर वाले जंगली प्रकार प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित किया जा सकता है और ट्यूमर के विकास की निगरानी 14 दिनों के लिए की जानी चाहिए। दिन में 14 चूहों बलिदान कर रहे हैं, ट्यूमर हटा दिया और उनके संवहनी मूल्यांकन के साथ कटौती. कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल में विवो के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान करता है प्राथमिक कोशिकाओं की angiogenic क्षमता का मूल्यांकन, जैसे ट्यूमर संबद्ध न्यूट्रोफिल के रूप में, कृत्रिम न्यूट्रोफिल सेल लाइन मॉडल का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना. कुलपति
Introduction
प्रकार मैं इंटरफेरॉन्स (IFNs) neoplasias के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं की उत्तेजना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, प्रकार की कमी के रूप में मैं IFN संकेतन काफी ऊंचा ट्यूमर विकास1में परिणाम . इस प्रक्रिया में शामिल तंत्रों में से एक ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल की ट्यूमरीनिक गतिविधि का विनियमन है, जिसे कॉलोनी-उत्तेजक कारक 3 रिसेप्टर (सीएसएफ3आर) डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग2द्वारा नियंत्रित किया जाता है। कालोनी-उत्तेजक कारक 3 (सीएसएफ3), या ग्रेनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक, निकोटिनमाइड फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफरेज(एनएएमपीटी) 3,4. NAMPT Nicotinamide adenine dinucleotide संश्लेषण के लिए एक दर सीमा एंजाइम है, जो ग्लाइकोलिओसिस को बढ़ाता है और डीएनए की मरम्मत को नियंत्रित करता है, जीन अभिव्यक्ति, और तनाव प्रतिक्रिया कैंसर कोशिकाओं के अस्तित्व और प्रसार को बढ़ावा देने5. NAMPT कोलोरेक्टल, डिम्बग्रंथि, स्तन, गैस्ट्रिक, प्रोस्टेट कैंसर और ग्लिओमास6सहित कई कैंसर प्रकार, में overexpressed है। NAMPT ट्यूमर कोशिकाओं के लिए न केवल आवश्यक है, लेकिन यह भी अन्य सेल प्रकार है कि ट्यूमर में मौजूद हैं की एक विस्तृत विविधता के लिए, माइलॉयड कोशिकाओं के रूप में – यह उनके भेदभावड्राइव 4, apoptosis रोकता है और कई cytokines की अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित या मैक्रोफेज में मैट्रिक्स-डिग्रेडिंग एंजाइम7|
ट्यूमर-संबद्ध न्यूट्रोफिल ट्यूमर विकास के महत्वपूर्ण न्यूनाधिक का प्रतिनिधित्व करते हैं। TAN फ़ंक्शन दृढ़ता से प्रकार I IFN उपलब्धता पर निर्भर हैं, क्योंकि ये साइटोकिन्स न्यूट्रोफिल की प्रमुख एंटी-ट्यूमर गतिविधि है। इसके विपरीत, IFNs की अनुपस्थिति इन कोशिकाओं के ट्यूमरीजेनिक सक्रियण का समर्थन करता है, विशेष रूप से उनके समर्थक एंजियोजेनिक गुण. इस के साथ समझौते में, IFNs में कमी चूहों काफी बड़ा और बेहतर संवहनी ट्यूमर का विकास, जो दृढ़ता से समर्थक के साथ घुसपैठ कर रहे हैं/ 9,10. महत्वपूर्ण बात यह है कि इस तरह के समर्थक-एंजियोजेनिक TANs NAMPT की ऊंचा गतिविधि दिखाते हैं, न्यूट्रोफिल के समर्थक ट्यूमर ध्रुवीकरण में अपनी आवश्यक भूमिका का सुझाव देते हैं।
Ly6G एंटीबॉडी का उपयोग कर न्यूट्रोफिल की कमी या उनके प्रवास के निषेध (CXCR2 एंटीबॉडी) में कमी ट्यूमर एंजियोजेनेसिस, विकास, और मेटास्टेसिस1,8में परिणाम. फिर भी, उत्पन्न मोनोक्लोनल एंटीबॉडी इम्यूनोजेनिक हैं, और उनका प्रशासन जीवन-धमकी देने वाले दुष्प्रभावों की एक श्रृंखला के साथ जुड़ा हुआ है11। छोटे अणुओं के साथ उपचार, जैसे NAMPT अवरोधक FK866, कि न्यूट्रोफिल tumorogenicity modulate, ऐसी जटिलताओं से बचने में मदद कर सकता है. दुर्भाग्य से, NAMPT के औषधीय प्रणालीगत निषेध, ट्यूमर के विकास पर अपने चिकित्सीय प्रभाव के बगल में, जठरांत्र विषाक्तता और थ्रोम्बोसाइटोपेनिया सहित गंभीर साइड इफेक्ट की ओर जाता है. इसलिए, एनएएमपीटी अवरोधकों का प्रणालीगत अनुप्रयोग संभव नहीं है12,13,14.
इस कारण से, हम यहाँ एक प्रोटोकॉल जहां NAMPT गतिविधि सीधे अलग TANs में अवरुद्ध है सुझाव देते हैं. इस तरह के विरोधी ट्यूमर न्यूट्रोफिल तो adoptively एक ट्यूमर असर मेजबान में स्थानांतरित कर रहे हैं। यह प्रोटोकॉल यौगिकों के प्रणालीगत विषाक्त दुष्प्रभावों से बचने में मदद करेगा, जबकि लक्ष्य कोशिकाओं पर इसके प्रभाव को बनाए रखा जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
शल्य चिकित्सा और औषधीय कैंसर के उपचार में प्रगति के बावजूद, सफल चिकित्सा एक चुनौती बनी हुई है. चूंकि प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्यूमर के विकास के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हमारे काम ड्यूश Krebshilfe, अनुदान संख्या से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: 111647, और जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG), अनुदान संख्या: JA 2461 2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
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