Trasferimento di neutrofili associati al tumore manipolati in topi che portano il tumore per studiare il loro potenziale angiogenico In Vivo
Summary
Qui, mostriamo il potenziale terapeutico dei neutrofili anti-angiogenici associati al tumore dopo il loro trasferimento in topi portatori di tumore. Questo protocollo può essere utilizzato per manipolare l’attività dei neutrofili ex vivo e successivamente valutare la loro funzionalità in vivo nello sviluppo di tumori. È un modello appropriato per studiare potenziali immunoterapie a base di neutrofili.
Abstract
Il contributo dei neutrofili alla regolazione della tumorigenesi sta ricevendo una maggiore attenzione. Queste cellule sono eterogenee, e a seconda dell’ambiente tumorale può possedere capacità pro o anti-tumorale. Una delle citochine importanti che regolano le funzioni neutrofili in un contesto tumorale sono gli interferoni di tipo I. In presenza di interferoni, i neutrofili ottengono proprietà antitumorali, tra cui citotossicità o stimolazione del sistema immunitario. Al contrario, l’assenza di un segnale di interferone si traduce in un’attività pro-tumorale prominente, caratterizzata da una forte stimolazione dell’angiogenesi tumorale. Recentemente, potremmo dimostrare che le proprietà pro-angiogeniche dei neutrofili dipendono dall’attivazione del percorso di segnalazione del fosfororiboyltransferae nicotina (NAMPT) in queste cellule. L’inibizione di questa via nei neutrofili associati al tumore porta al loro potente fenotipo anti-angiogenico. Qui, dimostriamo il nostro modello appena stabilito che consente la valutazione in vivo del potenziale tumorale dei neutrofili associati al tumore manipolati (TAN). A breve, i neutrofili pro-angiogenici associati al tumore possono essere isolati da topi carenti di interferonzi otumorali e ripolarti in fenotipi anti-angiogenici bloccando la segnalazione NAMPT. L’attività angiogenica di queste cellule può essere successivamente valutata utilizzando un saggio ad anello aortico. I TAN anti-angiogenici possono essere trasferiti in destinatari di tipo selvaggio portatori di tumore e la crescita del tumore deve essere monitorata per 14 giorni. Al giorno 14 topi vengono sacrificati, tumori rimossi e tagliati con la loro vascolarizzazione valutata. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un nuovo strumento per valutare la capacità angiogenica delle cellule primarie, come i neutrofili associati al tumore, senza la necessità di utilizzare modelli di linee cellulari artificiali di neutrofili. Vc
Introduction
Gli interferoni di tipo I (IFN) svolgono un ruolo importante nella stimolazione delle risposte dell’ospite alle neoplasie, poiché la mancanza di segnalazione IFN di tipo I si traduce in una crescita tumorale significativamente elevata1. Uno dei meccanismi coinvolti in questo processo è la regolazione dell’attività tumorale dei neutrofili associati al tumore, che è controllata dalla segnalazione a valle del fattore di stimolazione della colonia 3 (CSF3R). Il fattore stimolante della colonia 3 (CSF3), o fattore di stimolazione della colonia di granulociti, ha dimostrato di attivare la segnalazione che coinvolge la tosfororibosyltransferae alla nicotinamina (NAMPT)3,4. NAMPT è un enzima che limita il tasso per la sintesi di dinucleotide dell’adenina nicotinamide, che migliora la glicolisi e regola la riparazione del DNA, l’espressione genica e la risposta allo stress promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule tumorali5 . NAMPT è sovraespresso in più tipi di cancro, tra cui colorettale, ovarico, seno, gastrico, cancro alla prostata e glioma6 . NAMPT è essenziale non solo per le cellule tumorali, ma anche per una grande varietà di altri tipi di cellule presenti nei tumori, come le cellule mieloidi – guida la loro differenziazione4, inibisce l’apoptosi e stimola l’espressione di citochine multiple o enzimi degradanti in macrofagi7.
I neutrofili associati al tumore rappresentano importanti modulatori della crescita tumorale. Le funzioni TAN dipendono fortemente dalla disponibilità IFN di tipo I, in quanto queste citochine primo attività anti-tumorale dei neutrofili. Al contrario, l’assenza di IFN supporta l’attivazione cancerogena di queste cellule, in particolare le loro proprietà pro-angiogeniche. In accordo con questo, i topi carenti in IFN sviluppano tumori vascolarizzati significativamente più grandi e migliori, che sono fortemente infiltrati con neutrofili pro-tumorale / pro-angiogenico1,2,8, 9,10. È importante sottolineare che tali TAN pro-angiogenici mostrano un’elevata attività di NAMPT, suggerendo il suo ruolo essenziale nella polarizzazione pro-tumorale dei neutrofili.
L’esaurimento dei neutrofili usando anticorpo Ly6G o inibizione della loro migrazione (anticorpo CXCR2) provoca una diminuzione dell’angiogenesi tumorale, crescita, e metastasi1,8. Tuttavia, gli anticorpi monoclonali generati sono immunogenici e la loro somministrazione è associata a una serie di effetti collaterali pericolosi per la vita11. Il trattamento con piccole molecole, come l’inibitore NAMPT FK866, che modula la tumoriogenicità dei neutrofi, potrebbe aiutare a evitare tali complicazioni. Sfortunatamente, l’inibizione sistemica farmacologica di NAMPT, accanto al suo effetto terapeutico sulla crescita del tumore, porta a gravi effetti collaterali tra cui tossicità gastrointestinale e trombocitopenia. Pertanto, l’applicazione sistemica degli inibitori NAMPT non è fattibile12,13,14.
Per questo motivo, è possibile suggerire un protocollo in cui l’attività NAMPT viene bloccata direttamente in TAN isolati. Tali neutrofili anti-tumorale vengono poi trasferiti adottivamente in un ospite portatore di tumori. Questo protocollo aiuterà a evitare gli effetti collaterali tossici sistemici dei composti, mentre il suo effetto sulle cellule bersaglio sarà sostenuto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante i progressi nel trattamento chirurgico e farmacologico del cancro, la terapia di successo rimane una sfida. Poiché le cellule immunitarie sono noti per svolgere un ruolo importante nella regolazione della crescita del tumore, dovrebbero essere stabiliti nuovi metodi che inibiscono la tumorigenicità di tali cellule. Qui dimostriamo un nuovo approccio per sopprimere la crescita tumorale attraverso il trasferimento adottivo di neutrofili anti-angiogenici associati al tumore. Il targeting selettivo della segnala…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il nostro lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Deutsche Krebshilfe, Grant Number: 111647, e German Research Council (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
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