操作された腫瘍関連好中球を腫瘍性マウスに移植し、生体内の血管新生電位を研究する
Summary
ここで、腫瘍担持マウスへの移植後の抗血管新腫腫瘍関連好中球の治療可能性を示す。このプロトコルは、好中球活性ex vivoを操作し、その後、腫瘍の発達における生体内でその機能性を評価するために使用することができる。これは、潜在的な好中球ベースの免疫療法を研究するための適切なモデルです。
Abstract
腫瘍形成の調節に対する好中球の寄与が注目を集めている。これらの細胞は不均一であり、腫瘍に応じて、プロまたは抗腫瘍能力を有することができる。腫瘍コンテキストにおける好中球機能を調節する重要なサイトカインの1つは、I型インターフェロンである。インターフェロンの存在下では、好中球は、細胞毒性または免疫系の刺激を含む抗腫瘍特性を得る。逆に、インターフェロンシグナル伝達の欠如は顕著なプロ腫瘍活性をもたらす、腫瘍血管新生の強い刺激を特徴とする。最近、好中球の血管新生作用は、これらの細胞におけるニコチンアミドリンオリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)シグナル伝達経路の活性化に依存することを実証することができた。腫瘍関連好中球におけるこの経路の阻害は、それらの強力な抗血管新生表現型をもたらす。ここでは、新たに確立されたモデルを実証し、腫瘍関連好中球(TAN)の腫瘍性電位の生体内評価を可能にする。まもなく、腫瘍に関連する腫瘍関連好中球は、腫瘍担持性インターフェロン欠損マウスから単離し、NAMPTシグナル伝達の遮断によって抗血管新生表現型に再分極することができる。これらの細胞の血管新生活性は、その後、大動脈環アッセイを用いて評価することができる。抗血管新生TANは、腫瘍を有する野生型レシピエントに転移することができ、腫瘍の増殖を14日間監視する必要があります。14日目にマウスを屠殺し、腫瘍を除去し、血管を評価して切断する。全体として、我々のプロトコルは、人工好中球細胞株モデルを使用する必要なしに、腫瘍関連好中球などの一次細胞の血管新生容量を生体内で評価するための新しいツールを提供する。Vc
Introduction
タイプIインターフェロン(IFN)は、新生物に対する宿主応答の刺激において重要な役割を果たし、タイプI IFNシグナル伝達の欠如は腫瘍増殖を有意に上昇させる1.このプロセスに関与するメカニズムの1つは、腫瘍関連好中球の腫瘍活性の調節であり、これはコロニー刺激因子3受容体(CSF3R)下流シグナル伝達2によって制御される。コロニー刺激因子3(CSF3)、または顆粒球コロニー刺激因子は、ニコチンアミドホスオリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)3、4を含むシグナル伝達を活性化することが示された。NAMPTは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド合成のためのレート制限酵素であり、これは糖分解を増強し、DNA修復、遺伝子発現、および癌細胞の生存および増殖を促進するストレス応答を調節する5。NAMPTは、大腸、卵巣、乳房、胃、前立腺癌および神経膠腫6を含む複数の癌タイプで過剰発現される。NAMPTは、腫瘍細胞だけでなく、骨髄細胞などの腫瘍に存在する他の多種多様な細胞型に不可欠であり、その分化を促進し、アポトーシスを阻害し、複数のサイトカインの発現を刺激するか、マクロファージ7におけるマトリックス分解酵素。
腫瘍関連好中球は、腫瘍増殖の重要な調節因子を表す。TAN機能は、これらのサイトカインが好中球の主要な抗腫瘍活性として、I型IFNの利用可能性に強く依存する。反対に、IFNの不在は、これらの細胞、特に血管新生作用の腫瘍性活性化を支持する。これに合致して、IFNに欠損したマウスは、腫瘍/陽間異性好中球1、2、8、および強く浸潤している有意に大きく、より良い血管腫瘍を発症する。9,10.重要なことに、このような血管新生TANはNAMPTの活性の上昇を示し、好中球の腫瘍偏光にその重要な役割を示唆している。
Ly6G抗体を用いた好中球の枯渇またはそれらの移行の阻害(CXCR2抗体)は、腫瘍血管新生、増殖、および転移1、8の減少をもたらす。それにもかかわらず、生成されたモノクローナル抗体は免疫原性であり、その投与は生命を脅かす副作用の範囲と関連している11。好中球腫瘍原性を調節するNAMPT阻害剤FK866などの低分子による治療は、そのような合併症を回避するのに役立つ可能性がある。残念ながら、NAMPTの薬理学的全身阻害は、腫瘍増殖に対するその治療効果の隣に、胃腸毒性および血小板減少症を含む重篤な副作用をもたらす。したがって、NAMPT阻害剤の全身的な適用は、12、13、14では実現可能ではない。
このため、ここでは、NAMPT アクティビティが分離された TAN で直接ブロックされるプロトコルを提案します。このような抗腫瘍好中球は、次に、腫瘍担持宿主に採用的に伝達される。このプロトコルは、化合物の全身毒性副作用を回避するのに役立ちます, 標的細胞への影響が持続しながら、.
Protocol
Representative Results
Discussion
外科的および薬理学的癌治療の進歩にもかかわらず、成功した治療は挑戦のままである。免疫細胞は腫瘍増殖の調節に重要な役割を果たすることが知られているので、このような細胞の腫瘍原性を阻害する新しい方法を確立する必要があります。ここでは、抗血管新生腫瘍関連好中球の養子転移を介して腫瘍増殖を抑制する新しいアプローチを示す。TANにおける血管新生性NAMPTシグナル伝達?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの仕事は、ドイツのクレブシルフ、助成金番号:111647、ドイツ研究評議会(DFG)、助成番号:JA 2461/2-1からの助成金によって支えられました。
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
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