Overføring av manipulert tumor-Associated nøytrofile til tumor-bærende mus for å studere deres angiogenic potensial in vivo
Summary
Her viser vi terapeutiske potensialet i anti-angiogenic tumor-assosiert nøytrofile etter overføring til tumor bærende mus. Denne protokollen kan brukes til å manipulere nøytrofile aktivitet ex vivo og til senere evaluere sin funksjonalitet i vivo i utvikling av svulster. Det er en passende modell for å studere potensielle nøytrofile-baserte immunterapi.
Abstract
Bidraget av nøytrofile til regulering av tumorigenesis blir økt oppmerksomhet. Disse cellene er heterogene, og avhengig av tumor miljøet kan ha Pro-eller anti-tumor kapasitet. En av de viktige cytokiner regulere nøytrofile funksjoner i en tumor sammenheng er typen jeg interferoner. I nærvær av interferoner, nøytrofile Gain anti-tumor egenskaper, inkludert cytotoksisitet eller stimulering av immunsystemet. Omvendt, fraværet av en interferon signalering resulterer i fremtredende Pro-tumor aktivitet, karakterisert med sterk stimulering av tumor angiogenese. I den seneste tid, vi kunne demonstrere det Pro-angiogenic eiendom av nøytrofile avhenger på aktivisering av nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) signalveien inne disse celler. Hemming av denne veien i tumor-assosiert nøytrofile fører til deres potente anti-angiogenic fenotype. Her viser vi vår nyopprettede modellen tillater in vivo evaluering av tumorigene potensialet i manipulert tumor-assosiert nøytrofile (TANs). Kort tid, Pro-angiogenic tumor-assosiert nøytrofile kan isoleres fra tumor-bærende interferon-mangelfull mus og repolarized inn anti-angiogenic fenotype ved blokkering av NAMPT signalering. Den angiogenic aktiviteten til disse cellene kan senere evalueres ved hjelp av en aorta ring analysen. Anti-angiogenic TANs kan overføres til tumor-bærende ville type mottakere og tumor vekst bør overvåkes i 14 dager. På dag 14 mus er ofret, svulster fjernet og kuttet med sine endometrial blodkar vurdert. Samlet sett gir vår protokoll en ny verktøyet til in vivo evaluere angiogenic kapasitet på primære celler, slik som tumor-assosiert nøytrofile, uten behov for å bruke kunstige nøytrofile cellelinje modeller. Vc
Introduction
Type I interferoner (IFNs) spiller en viktig rolle i stimulering av vert svar til neoplasias, som mangel på type jeg IFN signalering resulterer i betydelig forhøyet tumor vekst1. En av mekanismene som er involvert i denne prosessen er regulering av tumorigene aktivitet av tumor-assosiert nøytrofile, som er kontrollert av koloni-stimulerende faktor 3 reseptor (CSF3R) nedstrøms signalering2. Colony-stimulerende faktor 3 (CSF3), eller granulocytt koloni-stimulerende Factor, ble vist å aktivere signalering som involverer nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT)3,4. NAMPT er en rate-begrensende enzym for nikotinamid adenine dinucleotide syntese, som forbedrer Glykolysen og regulerer DNA reparasjon, genuttrykk, og stress respons fremme kreftceller overlevelse og spredning5. NAMPT er overexpressed i flere krefttyper, inkludert tykk tarms, eggstokkene, bryst, mage, prostata kreft og gliomas6. NAMPT er viktig ikke bare for tumorceller, men også for en rekke andre celletyper som er til stede i svulster, slik som myelogen celler-det driver sin differensiering4, hemmer apoptose og stimulere uttrykk for flere cytokiner eller matrise-nedverdigende enzymer i makrofager7.
Tumor-assosiert nøytrofile representerer viktig modulatorer av tumor vekst. TAN funksjoner er sterkt avhengig av typen jeg IFN tilgjengelighet, da disse cytokiner Prime anti-tumor aktivitet av nøytrofile. Tvert imot, fraværet av IFNs støtter tumorigene aktivering av disse cellene, spesielt deres Pro-angiogenic egenskaper. I samråd med dette, mus mangelfull i IFNs utvikle betydelig større og bedre vascularized svulster, som er sterkt infiltrere med Pro-tumoral/Pro-angiogenic nøytrofile1,2,8, 9,10. Viktigere, slik Pro-angiogenic TANs viser forhøyet aktivitet av NAMPT, antyder sin viktige rolle i Pro-tumor polarisering av nøytrofile.
Nedbryting av nøytrofile ved bruk av Ly6G antistoff eller hemming av deres migrasjon (CXCR2 antistoff) resulterer i nedsatt tumor angiogenese, vekst og metastasering1,8. Likevel, genererte monoklonale antistoffer er immunogenic, og deres administrasjon er forbundet med en rekke livstruende bivirkninger11. Behandling med små molekyler, slik som NAMPT-hemmer FK866, som modulere nøytrofile tumoriogenicity, kan bidra til å unngå slike komplikasjoner. Dessverre, farmakologisk systemisk hemming av NAMPT, ved siden av sin terapeutiske effekt på tumor vekst, fører til alvorlige bivirkninger, inkludert Gastrointestinal toksisitet og trombocytopeni. Derfor er systemisk anvendelse av NAMPT hemmere ikke gjennomførbart12,13,14.
Derfor foreslår vi en protokoll der NAMPT-aktivitet blokkeres direkte i isolerte TANs. Slike anti-tumor nøytrofile blir deretter adoptively overført til en svulst-bærende vert. Denne protokollen vil bidra til å unngå systemiske giftige bivirkninger av forbindelsene, mens dens effekt på målcellene vil bli opprettholdt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til tross for framgang i kirurgisk og farmakologisk kreft behandling, er vellykket terapi fortsatt en utfordring. Siden immunceller er kjent for å spille en viktig rolle i regulering av tumor vekst, romanen metoder hemme tumorgenisitet hos av slike celler bør etableres. Her viser vi en ny tilnærming for å undertrykke tumor vekst via adoptiv overføring av anti-angiogenic tumor-assosiert nøytrofile. Selektiv målretting av Pro-angiogenic NAMPT signalering i TANs, ved hjelp av FK866 inhibitor, hindrer bivirkninger, so…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vårt arbeid ble støttet av tilskudd fra Deutsche Krebshilfe, Grant nummer: 111647, og German Research Council (DFG), Grant nummer: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -. F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Recherche en cancérologie. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
