Transferência de neutrophils tumor-associados manipulados em ratos do tumor-rolamento para estudar seu potencial angiogênico em vivo
Summary
Aqui, nós mostramos o potencial terapêutico de neutrófilos tumor-associados antiangiogénicos após sua transferência em ratos tumor-tendo. Este protocolo pode ser utilizado para manipular a atividade de neutrófilos ex vivo e posteriormente avaliar sua funcionalidade in vivo no desenvolvimento de tumores. É um modelo adequado para o estudo de potenciais imunoterapias à base de neutrófilos.
Abstract
A contribuição de neutrófilos para a regulação da tumorigenese está recebendo maior atenção. Estas pilhas são heterogêneas, e dependendo do meio do tumor pode possuir a capacidade pro-ou do anti-tumor. Um dos citocinas importantes que regulam funções do neutrófilo em um contexto do tumor é tipo mim interferons. Na presença de interferões, neutrófilos ganham propriedades antitumorais, incluindo citotoxicidade ou estimulação do sistema imunológico. Inversamente, a ausência de uma sinalização do interferon conduz à atividade proeminente do pro-tumor, caracterizada com a estimulação forte da angiogênese do tumor. Recentemente, nós poderíamos demonstrar que as propriedades pro-Angiogenic dos neutrófilos dependem da ativação da via de sinalização do Fosforribosiltransferase do nicotinamida (NAMPT) nestas pilhas. A inibição desta via em neutrófilos tumor-associados conduz a seu phenotype antiangiogénico potente. Aqui, Nós demonstramos nosso modelo recentemente estabelecido permitindo in vivo a avaliação do potencial tumorigênico de neutrófilos tumor-associados manipulados (tans). Logo, os neutrófilos tumor-associados pro-Angiogenic podem ser isolados dos ratos interferon-deficientes do tumor-rolamento e repolarizado no phenotype antiangiogénico obstruindo da sinalização de NAMPT. A atividade angiogênica dessas células pode ser posteriormente avaliada por meio de um ensaio de anel aórtico. Os TANs antiangiogénicos podem ser transferidos em receptores do tipo selvagem do tumor-rolamento e o crescimento do tumor deve ser monitorado por 14 dias. No dia 14 camundongos são sacrificados, tumores removidos e cortados com sua vascularização avaliada. Globalmente, nosso protocolo fornece uma nova ferramenta para in vivo avaliar a capacidade angiogênica de células primárias, tais como neutrophils associados a tumores, sem a necessidade de usar modelos de linha celular de neutrófilos artificiais. vc
Introduction
Os interferões do tipo I (IFNs) desempenham um papel importante na estimulação das respostas do hospedeiro às Neoplasias, pois a falta de sinalização do tipo I IFN resulta em crescimento tumoral significativamente elevado1. Um dos mecanismos envolvidos neste processo é a regulação da atividade tumorigênica de neutrófilos tumor-associados, que é controlado pela sinalização a jusante do receptor de fator 3 (CSF3R) que estimula a colônia2. Fator estimulante de colônia 3 (CSF3), ou fator estimulador de colônias de granulócitos, demonstrou-se ativar a sinalização envolvendo a nicotinamida Fosforibosiltransferase (NAMPT)3,4. O NAMPT é uma enzima limitadora de taxa para a síntese de dinucleotídeo de nicotinamida adenina, que melhora a glicólise e regula o reparo do DNA, a expressão gênica e a resposta ao estresse promovendo a sobrevivência e proliferação de células cancerosas5. O NAMPT é superexpresso em vários tipos de câncer, incluindo câncer colorretal, ovariano, mama, gástrico, próstata e gliomas6. O NAMPT é essencial não só para as células tumorais, mas também para uma grande variedade de outros tipos de células que estão presentes em tumores, tais como células mielóides-que impulsiona a sua diferenciação4, inibe a apoptose e estimula a expressão de múltiplas citocinas ou enzimas degradantes da matriz em macrófagos7.
Os neutrófilos tumor-associados representam moduladores importantes do crescimento do tumor. As funções TAN são fortemente dependentes da disponibilidade do tipo I IFN, pois estas citocinas Prime a atividade antitumoral dos neutrófilos. Ao contrário, a ausência de ifns apoia a ativação tumorigênico destas pilhas, especial suas propriedades pro-Angiogenic. De acordo com isso, camundongos deficientes em ifns desenvolvem tumores vascularizados significativamente maiores e melhores, que são fortemente infiltrados com neutrófilos pró-tumorais/pró-angiogênicos1,2,8, 9,10. Importante, tais TANs pro-Angiogenic mostram a atividade elevada de NAMPT, sugerindo seu papel essencial na polarização do pro-tumor dos neutrófilos.
A depleção de neutrófilos usando Ly6G anticorpo ou inibição de sua migração (CXCR2 anticorpo) resulta em diminuição da angiogênese tumoral, crescimento e metástase1,8. Não obstante, os anticorpos monoclonais gerados são immunogenic, e sua administração é associada com uma escala de efeitos secundários life-threatening11. O tratamento com moléculas pequenas, tais como o inibidor FK866 de NAMPT, que modulam o tumoriogenicity do neutrófilo, poderia ajudar a evitar tais complicações. Infelizmente, a inibição sistemática farmacológica de NAMPT, ao lado de seu efeito terapêutico no crescimento do tumor, conduz aos efeitos secundários severos que incluem a toxicidade gastrintestinal e o thrombocytopenia. Portanto, a aplicação sistêmica de inibidores de NAMPT nãoé viável12,13,14.
Por esta razão, sugerimos aqui um protocolo onde a atividade de NAMPT é bloqueada diretamente em TANs isolados. Tais neutrófilos antitumorais são então transferidos adoptivamente em um hospedeiro de tumor-Bearing. Este protocolo ajudará a evitar efeitos colaterais tóxicos sistêmicos dos compostos, enquanto seu efeito sobre as células-alvo será sustentado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar do progresso no tratamento cirúrgico e farmacológico do cancro, a terapia bem sucedida permanece um desafio. Desde que as pilhas imunes são sabidas para jogar um papel importante na regulação do crescimento do tumor, os métodos novos que inibe o tumorigenicidade de tais pilhas devem ser estabelecidos. Aqui nós demonstramos uma aproximação nova para suprimir o crescimento do tumor através da transferência adoptiva de neutrófilos tumor-associados antiangiogénicos. A segmentação seletiva da sinalizaç?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O nosso trabalho foi apoiado por subvenções da Deutsche Krebshilfe, Grant Number: 111647, e do Conselho alemão de investigação (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
References
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