שיטת לוקליזציה vivo immunofluorescence ניתן להשתמש כדי לבחון ב vivo biodistribution של נוגדנים ושערי מעלה נוגדן למטרות אונולוגיות באורגניזמים חיים באמצעות שילוב של vivo הגידול מיקוד ולשעבר vivo חיסוני שיטות.
נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) הם כלים חשובים בזיהוי סרטן, אבחון וטיפול. הם משמשים כדי לפענח את התפקיד של חלבונים בטווריגנזה, ניתן להפנות בסמנים סרטניים המאפשרים איתור ואפיון הגידול, והוא יכול לשמש לטיפול בסרטן כמו mAbs או נוגדן תרופות המעלה להפעיל את התאים החיסונית החיסון, כדי לעכב איתות מסלולים, או ישירות להרוג תאים הנושאים את האנטיגן המסוים. למרות החידושים הקליניים בפיתוח וייצור של הרומן מאוד ספציפי mAbs, אבחון ויישומים טיפולית יכול להיות לקוי על ידי המורכבות והטרוגניות של מיקרוסביבה הגידול. כך, לפיתוח של טיפולים יעילים נוגדן מבוססי ודיאגנוסטיקה, זה חיוני כדי להעריך את ההתפלגות הביומלית ואינטראקציה של המשלים מבוסס נוגדן עם מיקרוסביבה הגידול החיים. כאן, אנו מתארים ב Vivo Immunofluorescence לוקליזציה (IVIL) כגישה חדשה ללמוד אינטראקציות של therapeutics מבוססי נוגדן ואבחון בתנאים פיסיולוגיים Vivo ופתולוגיים. בטכניקה זו, נוגדן טיפולי או אבחון ספציפי של אנטיגן הוא מוזרק באופן מvivo ומקומי לשעבר vivo עם נוגדן משני בגידולים מבודדים. לכן, לפיכך, משקף את vivo biodistribution של תרופות מבוססות נוגדן וסוכני מיקוד. שני יישומים IVIL מתוארים הערכת ביוהפצה ונגישות של סוכני ניגודיות מבוססי נוגדן עבור דימות מולקולרי של סרטן השד. פרוטוקול זה יאפשר למשתמשים עתידיים להתאים את שיטת ה-IVIL עבור יישומי מחקר מבוססי נוגדן שלהם.
נוגדנים חד-שבטיים (mAb) הם גליקורופנים גדולים (כ 150 kDa) של משפחת האימונוגלובולין המופרש על ידי תאי B ויש להם תפקיד עיקרי במערכת החיסונית כדי לזהות ולעכב את הפונקציה הביולוגית של, או לסמן עבור הרס, חיידקי או נגיפי פתוגנים, והוא יכול לזהות ביטוי חלבון חריג על תאים סרטניים1. נוגדנים יכולים להיות אהדה גבוהה מאוד האפיסקופים הספציפיים שלהם למטה בריכוזים של הנשים הללו הופכים אותם כלים מבטיחים ביותר ביודיקטנין2. עם פיתוח הטכנולוגיה היפידים על ידי מילשטיין ו Köהלר (הוענק פרס נובל ב 1984), הייצור של mAbs הפכה אפשרית3. מאוחר יותר, mabs האדם נוצרו באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage או זנים העכבר הטרנסגניים מהפכה שלהם לשימוש ככלי מחקר הרומן therapeutics4,5.
סרטן הוא נושא בריאות ברחבי העולם והגורם העיקרי של המוות יצירת הצורך גישות הרומן למניעת, זיהוי, וטיפול6. עד כה, mAbs אפשרו extrication של התפקיד של גנים והחלבונים שלהם בטומגנזה וכאשר מכוונים נגד בדיקות סרטן, יכול לאפשר זיהוי גידולים ואפיון עבור המטופל ריבוד. עבור טיפול בסרטן, mAbs מיוחד, נוגדן סמים שערי מעלה, ושברי נוגדנים קטנים מפותחים כמו therapeutics, ועל מסירת התרופה ממוקד כדי לשפר את היעילות הטיפולית7. בנוסף, נוגדנים לשרת מיקוד הסמנים של סוכני ניגודיות עבור הדמיה מולקולרית שיטות כגון כירורגיה פלואורסצנטית מונחה, פוטואקוסטית (PA) הדמיה, אולטרסאונד (ארה ב) הדמיה מולקולרית, ו קלינית פליטת פוזיטרון טומוגרפיה ממוחשבת (PET) או טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון (מחשב)8. לבסוף, נוגדנים יכולים לשמש גם כסוכני theranostic המאפשרים ריבוד של חולים וניטור תגובה עבור טיפולים ייעודיים9. לכן, mAbs הרומן מתחילים לשחק תפקיד קריטי באיתור סרטן, אבחון, וטיפול.
למרות החידושים הקריטיים בפיתוח וייצור של הרומן מאוד ספציפי mAbs, אבחון ויישומים טיפולית יכול להיות מעובד בלתי יעיל בשל המורכבות של סביבת הגידול. אינטראקציות הנוגדן תלויות על סוג האפירופה, כלומר, בין אםהוא ליניאריאו בקונפורמציה10. בנוסף להכרה של אנטיגנים, נוגדנים צריכים להתגבר על מחסומים טבעיים כגון קירות כלי, קרום בסיס, ואת משתית הגידול כדי להגיע לתאי היעד לבטא את האנטיגן. נוגדנים לקיים אינטראקציה עם הרקמה לא רק באמצעות משתנה כריכה אנטיגן המקטע (Fab) התחום אלא גם דרך השבר הגבישי הקבוע (Fc) אשר מוביל עוד יותר מחוץ לאתר אינטראקציות11. המיקוד הוא גם מסובך על ידי הביטוי הטרוגנית של סמנים הגידול לאורך הגידול בצובר וטרוגניות בגידול vascularization ומערכת lymphatics12,13. בנוסף, מיקרוסביבה הגידול מורכב סרטן הקשורים פיברותקיעות אשר תומכים בתאי הגידול, הגידול תאים חיסוניים לדכא את התגובות החיסונית נגד הגידול, ואת אנדותל הגידול התומך הובלה של חמצן וחומרים מזינים, כל אשר מפריעים לחדירה, להפצה ולזמינות של therapeutics או אבחון מבוססי נוגדן. בסך הכל, שיקולים אלה יכולים להגביל את היעילות הטיפולית או אבחון, להפחית את תגובת הטיפול, ועלול לגרום להתנגדות לגידול.
לכן, לפיתוח של טיפולים יעילים נוגדן מבוססי ודיאגנוסטיקה, זה חיוני כדי להעריך את ההתפלגות הביומלית ואינטראקציה של המשלים מבוססי נוגדן בתוך מיקרוסביבה הגידול. כיום, במחקרים פרה-קליניים, ביטוי סמן מודלים מחקר הגידול מנותח ex vivo על ידי immunofluorescence (IF) כתמים של סעיפים הגידול14. תקן IF כתמים מבוצע עם נוגדנים ספציפיים סמן העיקרי אשר מודגשים אז על ידי נוגדנים משני התווית על הרקמה לשעבר vivo רקמות הגידול שהיו מבודדים מהחיה. טכניקה זו מדגיש את המיקום הסטטי של הסמן בזמן קיבוע רקמות אינו מספק תובנה כיצד therapeutics מבוסס נוגדן או אבחון עשוי להפיץ או אינטראקציה בתנאים פיזיולוגיים. הדמיה מולקולרית על ידי PET, הזהיר, ארה ב, ו-PA יכול לספק מידע על התפלגות נוגדן הסוכן בניגוד מצומדת בחיים מודלים פרה8,15. כמו אלה שיטות הדמיה הם לא פולשנית, מחקרים האורך ניתן לבצע ונתונים רגישים לזמן ניתן לאסוף עם מספר מינימלי של בעלי חיים לכל קבוצה. עם זאת, אלה לא פולשני גישות הדמיה מולקולרית אינם רגישים מספיק אין להם מספיק החלטה לוקליזציה של התפלגות נוגדן ברמה התאית. בנוסף, המאפיינים הפיזיים והביולוגיים של הנוגדן העיקרי עשויים להשתנות באופן דרסטי על ידי הקוניוגציה של סוכן ניגודיות16.
על מנת לקחת את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים vivo בהתחשב באופן הפעולה המבוסס על נוגדנים therapeutics ואבחון בתוך סביבת הגידול ולהשיג התפלגות תאית ברזולוציה גבוהה ואפילו תת-תאית פרופילים של נוגדנים שאינם מצוהרים, אנו מציעים גישה IF, הנחשבים לוקליזציה Vivo Immunofluorescence (IVIL), שבו הנוגדן הספציפי אנטיגן מוזרק באופן מידי בVivo. נוגדן מבוססי טיפול או אבחון, מתנהג כנוגדן העיקרי, מסתובב כלי דם פונקציונלי נקשר החלבון היעד שלה בסביבת הגידול מדויק מאוד, חיים בסביבה. לאחר בידוד של גידולים vivo עם הנוגדן העיקרי, נוגדן משני משמש לוקליזציה מצטבר ונשמר שערים נוגדן. גישה זו דומה לזו שתוארה בעבר אם גישה היסטולוגיה הזרקת נוגדנים מתויג באופן שכותרתו17. למרות שכאן, השימוש בנוגדנים שאינם מצופנים מונע שינוי פוטנציאלי במאפייני ההתפלגות הביומלית הנגרמת על ידי שינוי נוגדנים. יתר על כן, היישום vivo ex של נוגדן משני פלורסנט מונע אובדן אפשרי של אות פלואורסצנטית במהלך איסוף רקמות ועיבוד ומספק הגברה של עוצמת אות פלואורסצנטית. הגישה שלנו תיוג משקף vivo biodistribution של תרופות מבוססות נוגדן סוכנים ייעודיים והוא יכול לספק תובנות חשובות לפיתוח של סוכני אבחון וריפוי הרומן.
כאן, אנו מתארים שני יישומים של שיטת IVIL כפי שהוחלו במחקרים קודמים בחקירת ביוהפצה ונגישות של סוכני הניגודיות מבוססי נוגדן עבור גישות הדמיה מולקולרית לאיתור סרטן השד. ראשון, התפלגות biodistribution נוגדן-ליד צבע אינפרא אדום המשלים (anti-B7-H3 נוגדן מאוגד לצבוע בסמוך אינפרא אדום, indocyanine ירוק, B7-H3-ICG) ואת הסוכן בקרת isotype (Iso-ICG) עבור הקרינה הפלואורסצנטית ו-photoacoustic מולקולרית הדמיה מחקר18. שיטת יישום זו מתוארת בפרוטוקול. לאחר מכן, תוצאות ההתפלגות הביומלית של נוגדנים רגישים מבחינה מבצעית לנטרין -1, בדרך כלל לא לזיהוי עם הדמיה IF מסורתית, בשימוש עם דימות מולקולרי אולטרסאונד, הוא כימות והציג בתוצאות הנציג19. בסיום זה נייר פרוטוקול, הקוראים צריכים להרגיש בנוח לאמץ את שיטת ה-IVIL עבור יישומי מחקר מבוססי נוגדן שלהם.
שיטה זו כוללת מספר שלבים קריטיים ומחייבת שינויים פוטנציאליים כדי להבטיח יישום מוצלח. ראשית, את המינון ואת העיתוי של הנוגדן/הנוגדן המשלים ולאחר ההזרקה חייב להיות מותאם ליישום ספציפי. באופן כללי, המינונים צריך לשמש כי הם עקביים עם איך מחייב נוגדן בדרך כלל לשמש, כלומר, התאמת המינונים של הנוגד…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ד ר אנדרו אולסון (סטנפורד שירות מיקרוסקופ מדעי המוח) עבור דיונים ושימוש בציוד. אנו מודים לד ר ג’ורגן ק. ווילמן למנטוריו. מחקר זה נתמך על ידי NIH R21EB022214 מענק (קיו), NIH R25CA118681 מענק הכשרה (קיו), ו-NIH K99EB023279 (קיו). שירות מיקרוסקופ המוח של סטנפורד נתמך על ידי NIH NS069375.
Animal Model | |||
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
Animal Handling Supplies | |||
27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
Tissue Collection | |||
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Antibodies | |||
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
Reagents | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Supplies | |||
Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
Software | |||
FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |