Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer
Summary
El método de localización de inmunofluorescencia in vivo (IVIL) se puede utilizar para examinar la biodistribución in vivo de anticuerpos y conjugados de anticuerpos con fines oncológicos en organismos vivos utilizando una combinación de segmentación tumoral in vivo e inmunostainización ex vivo Métodos.
Abstract
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son herramientas importantes en la detección, diagnóstico y tratamiento del cáncer. Se utilizan para desentrañar el papel de las proteínas en la tumorigenesis, se pueden dirigir a biomarcadores de cáncer que permiten la detección y caracterización de tumores, y se pueden utilizar para la terapia contra el cáncer como mAbs o conjugados de anticuerpos-drogas para activar las células efectoras inmunes, para inhibir señaldelas, o matar directamente las células que llevan el antígeno específico. A pesar de los avances clínicos en el desarrollo y producción de mAbs novedosos y altamente específicos, las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas pueden verse afectadas por la complejidad y heterogeneidad del microambiente tumoral. Por lo tanto, para el desarrollo de terapias y diagnósticos eficientes basados en anticuerpos, es crucial evaluar la biodistribución y la interacción del conjugado basado en anticuerpos con el microambiente tumoral vivo. Aquí, describimos In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) como un nuevo enfoque para estudiar las interacciones de la terapéutica basada en anticuerpos y el diagnóstico en las condiciones fisiológicas y patológicas in vivo. En esta técnica, se inyecta invivo un anticuerpo terapéutico o diagnóstico específico para antígenos in vivo y localizado ex vivo con un anticuerpo secundario en tumores aislados. Por lo tanto, IVIL refleja la biodistribución in vivo de fármacos a base de anticuerpos y agentes dirigidos. Se describen dos aplicaciones de IVIL que evalúan la biodistribución y la accesibilidad de agentes de contraste basados en anticuerpos para la toma de imágenes moleculares del cáncer de mama. Este protocolo permitirá a los futuros usuarios adaptar el método IVIL para sus propias aplicaciones de investigación basadas en anticuerpos.
Introduction
Los anticuerpos monoclonales (mAb) son grandes glicoproteínas (aproximadamente 150 kDa) de la superfamilia inmunoglobulina que son secretadas por células B y tienen una función primaria en el sistema inmunitario para identificar e inhibir la función biológica de, o marcar para patógenos bacterianos o virales, y puede reconocer la expresión anormal de proteínas en las células cancerosas1. Los anticuerpos pueden tener una afinidad extremadamente alta con sus epítopos específicos hasta las concentraciones femtomolares, lo que los convierte en herramientas altamente prometedoras en biomedicina2. Con el desarrollo de la tecnología de hibrioma por Milstein y K-hler (galardonado con el Premio Nobel en 1984), la producción de mAbs se hizo posible3. Más tarde, los mAbs humanos se generaron utilizando la tecnología de visualización de fagos o cepas de ratón transgénicas y revolucionaron su uso como nuevas herramientas de investigación y terapias4,5.
El cáncer es un problema de salud mundial y una de las principales causas de muerte, creando la necesidad de nuevos enfoques para la prevención, detección y terapia6. Hasta la fecha, los mAbs han permitido la extricación del papel de los genes y sus proteínas en la tumorigenesis y cuando se dirigen contra biomarcadores de cáncer, pueden permitir la detección y caracterización del tumor para la estratificación del paciente. Para la terapia oncológica, se están desarrollando como terapias los mAbs biespecíficos, los conjugados de anticuerpos y los anticuerpos más pequeños, y para la administración de fármacos dirigidos para mejorar la eficacia terapéutica7. Además, los anticuerpos sirven para la focalización de biomarcadores de agentes de contraste para modalidades de imágenes moleculares como cirugía guiada por fluorescencia, imágenes fotoacústicas (PA), imágenes moleculares por ultrasonido (EE. UU.) y emisión de positrones clínicamente utilizada tomografía (PET) o tomografía computarizada por emisión de fotones individuales (SPECT)8. Por último, los anticuerpos también se pueden utilizar como agentes ranosóticos que permiten la estratificación de los pacientes y el seguimiento de la respuesta para las terapias dirigidas9. Por lo tanto, los nuevos mAbs están empezando a desempeñar un papel crítico en la detección, diagnóstico y tratamiento del cáncer.
A pesar de los avances críticos en el desarrollo y producción de mAbs novedosos y altamente específicos, las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas pueden hacerse ineficaces debido a la complejidad del entorno tumoral. Las interacciones de anticuerpos dependen del tipo de epítopo, es decir,desi es lineal o conformacional10. Además del reconocimiento de antígenos, los anticuerpos necesitan superar las barreras naturales como las paredes de los vasos, las membranas basales y el estroma tumoral para llegar a las células diana que expresan el antígeno. Los anticuerpos interactúan con el tejido no sólo a través del dominio de unión de antígeno de fragmento variable (Fab), sino también a través del fragmento cristalino constante (Fc) que conduce a las interacciones fuera del sitio11. La segmentación también se complica por la expresión heterogénea de los marcadores tumorales a lo largo del tumor a granel y la heterogeneidad en la vascularización tumoral y el sistema linfático12,13. Además, el microambiente tumoral se compone de fibroblastos asociados al cáncer que apoyan las células tumorales, células inmunitarias tumorales que suprimen las reacciones inmunitarias antitumorales, y el endotelio tumoral que apoya el transporte de oxígeno y nutrientes, todos que interfieren con la penetración, distribución y disponibilidad de terapias o diagnósticos basados en anticuerpos. En general, estas consideraciones pueden limitar la eficacia terapéutica o diagnóstica, reducir la respuesta al tratamiento y provocar resistencia a los tumores.
Por lo tanto, para el desarrollo de terapias y diagnósticos eficientes basados en anticuerpos, es crucial evaluar la biodistribución y la interacción del conjugado basado en anticuerpos dentro del microambiente tumoral. Actualmente, en estudios preclínicos, la expresión marcadora en modelos de investigación tumoral se analiza ex vivo mediante la tinción de inmunofluorescencia (IF) de las secciones14del tumor. La tinción IF estándar se realiza con anticuerpos específicos de marcadores primarios que luego se resaltan mediante anticuerpos separados fluorescentes mente capacitados en rodajas de tejido tumoral ex vivo que se han aislado del animal. Esta técnica destaca la ubicación estática del marcador en el momento de la fijación del tejido y no proporciona información sobre cómo las terapias o diagnósticos basados en anticuerpos podrían distribuirse o interactuar en condiciones fisiológicas. Las imágenes moleculares de PET, SPECT, US y PA pueden proporcionar información sobre la distribución de agentes de contraste conjugados con anticuerpos en los modelos preclínicos vivos8,15. Dado que estas modalidades de diagnóstico por imágenes no son invasivas, se pueden realizar estudios longitudinales y se pueden recopilar datos sensibles al tiempo con un número mínimo de animales por grupo. Sin embargo, estos enfoques de imágenes moleculares no invasivos no son lo suficientemente sensibles y no tienen suficiente resolución para la localización de la distribución de anticuerpos a nivel celular. Además, las características físicas y biológicas del anticuerpo primario pueden modificarse drásticamente por la conjugación de un agente de contraste16.
Con el fin de tener en cuenta las condiciones fisiológicas y patológicas in vivo de cómo interactúan y diagnostica la terapia basada en anticuerpos dentro del entorno tumoral y obtener una distribución celular e incluso subcelular de alta resolución perfiles de anticuerpos no conjugados, proponemos un enfoque IF, considerado In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL), en el que el anticuerpo específico del antígeno se inyecta in vivo por vía intravenosa. El tratamiento o diagnóstico basado en anticuerpos, que actúa como anticuerpo primario, circula en los vasos sanguíneos funcionales y se une a su proteína diana en el entorno tumoral vivo de alta precisión. Después del aislamiento de tumores in vivo-etiquetados con el anticuerpo primario, se utiliza un anticuerpo secundario para localizar conjugados de anticuerpos acumulados y retenidos. Este enfoque es similar a un enfoque histológico IF descrito anteriormente que inyecta anticuerpos etiquetados fluorescentemente17. Aunque aquí, el uso de anticuerpos no conjugados evita un cambio potencial en las características de biodistribución inducido por la modificación de anticuerpos. Además, la aplicación ex vivo de anticuerpos secundarios fluorescentes evita una posible pérdida de señal de fluorescencia durante la recolección y el procesamiento del tejido y proporciona amplificación de la intensidad de la señal de fluorescencia. Nuestro enfoque de etiquetado refleja la biodistribución in vivo de fármacos basados en anticuerpos y agentes específicos y puede proporcionar información importante para el desarrollo de nuevos agentes diagnósticos y terapéuticos.
Aquí, describimos dos aplicaciones del método IVIL aplicados en estudios anteriores que investigan la biodistribución y accesibilidad de agentes de contraste basados en anticuerpos para enfoques de imágenes moleculares para la detección del cáncer de mama. En primer lugar, la biodistribución de un conjugado de tinte infrarrojo cercano a los anticuerpos (anticuerpo anti-B7-H3 unido al tinte de fluorescencia infrarroja cercano, verde indocyanina, B7-H3-ICG) y el agente de control de isotipos (Iso-ICG) para fluorescencia y fotoacústica molecular imágenes se explora18. El método de esta aplicación se describe en el protocolo. A continuación, los resultados de la biodistribución de un anticuerpo sensible a la conformación a la netrina-1, normalmente no detectable con imágenes IF tradicionales, utilizadas con imágenes moleculares por ultrasonido, se cuantifican y presentan en los resultados representativos19. Al concluir este documento de protocolo, los lectores deben sentirse cómodos adoptando el método IVIL para sus propias aplicaciones de investigación basadas en anticuerpos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método tiene varios pasos críticos y requiere posibles modificaciones para garantizar una implementación correcta. En primer lugar, la dosis y el momento de la inyección intravenosa conjugada con anticuerpos/anticuerpos deben adaptarse a la aplicación específica. Generalmente, se deben utilizar dosis que sean consistentes con la forma en que el conjugado de anticuerpos se utilizará típicamente, es decir, dosis coincidentes del anticuerpo terapéutico o agente de contraste basado en anticuerpos. Además, se d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) por las discusiones y el uso del equipo. Agradecemos al Dr. Juergen K. Willmann por su tutoría. Este estudio fue apoyado por la subvención NIH R21EB022214 (KEW), NIH R25CA118681 (KEW) y NIH K99EB023279 (KEW). El Servicio de Microscopía de Neurociencia de Stanford fue apoyado por NIH NS069375.
Materials
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
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