In vivo Immunofluorescenslokalisering för bedömning av terapeutisk och diagnostisk antikropps biodistribution i cancer forskning
Summary
Metoden in vivo immunofluorescenslokalisering (IVIL) kan användas för att undersöka in vivo biodistribution av antikroppar och konjugat av antikroppar för onkologiska ändamål i levande organismer med hjälp av en kombination av in vivo tumör inriktning och ex vivo immunofärgning Metoder.
Abstract
Monoklonala antikroppar (mAbs) är viktiga verktyg för att upptäcka, diagnostisera och behandla cancer. De används för att riva upp den roll som proteiner i tumorigenes, kan riktas till cancer biomarkörer som möjliggör tumör detektion och karakterisering, och kan användas för cancerbehandling som mAbs eller antikropp-läkemedel konjugat för att aktivera immun effektorceller, att hämma signalvägar, eller direkt döda celler som bär det specifika antigenet. Trots kliniska framsteg i utvecklingen och produktionen av nya och mycket specifika mAbs, diagnostiska och terapeutiska tillämpningar kan försämras av komplexiteten och heterogenitet av tumören mikromiljö. Således, för utveckling av effektiva antikroppsbaserade terapier och diagnostik, det är viktigt att bedöma biodistribution och interaktion av antikropp-baserade konjugatet med levande tumör mikromiljö. Här beskriver vi in vivo Immunofluorescenslokalisering (IVIL) som en ny metod för att studera interaktioner mellan antikroppsbaserade Therapeutics och diagnostik i in vivo fysiologiska och patologiska tillstånd. I denna teknik injiceras en terapeutisk eller diagnostisk antigen-specifik antikropp intravenöst in vivo och lokaliserad ex vivo med en sekundär antikropp i isolerade tumörer. IVIL återspeglar därför in vivo biodistribution av antikroppsbaserade läkemedel och riktade medel. Två IVIL applikationer beskrivs bedömning av biodistribution och tillgänglighet av antikroppsbaserade kontrastmedel för molekylär avbildning av bröstcancer. Detta protokoll kommer att göra det möjligt för framtida användare att anpassa IVIL-metoden för sina egna antikroppsbaserade forskningstillämpningar.
Introduction
Monoklonala antikroppar (mAb) är stora glykoproteiner (ca 150 kDa) av den immunglobulin superfamiljen som utsöndras av B-celler och har en primär funktion i immunsystemet för att identifiera och antingen hämma den biologiska funktionen av, eller mark för förstörelse, bakteriella eller virala patogener, och kan känna igen onormala proteinuttryck på cancerceller1. Antikroppar kan ha en extremt hög affinitet till sina specifika epitoper ner till femtomolar koncentrationer vilket gör dem mycket lovande verktyg i biomedicin2. Med utvecklingen av Hybridomteknik teknologi av Milstein och Köhler (tilldelat Nobel priset i 1984), blev produktionen av Mabs möjligheten3. Senare, mänskliga Mabs genererades med hjälp av fagdisplay teknik eller transgena mus stammar och revolutionerade deras användning som nya forskningsverktyg och Therapeutics4,5.
Cancer är en global hälsofråga och en viktig dödsorsak som skapar behovet av nya metoder för att förebygga, upptäcka och terapi6. Hittills har Mabs tillåtit losstagning av rollen av gener och deras proteiner i tumorigenes och när riktas mot cancer biomarkörer, kan möjliggöra tumör detektering och karakterisering för patientens stratifiering. För cancerbehandling, bispecific mAbs, antikropp-läkemedel konjugat, och mindre antikroppar fragment utvecklas som Therapeutics, och för riktade läkemedelsleverans för att förbättra terapeutisk effekt7. Dessutom används antikroppar för biomarkör inriktning av kontrastmedel för molekylära avbildningsmetoder såsom fluorescensstyrd kirurgi, Fotoakustisk (PA) avbildning, ultraljud (US) molekylär avbildning, och kliniskt använda positron emission tomografi (PET) eller singelfotonemission datortomografi (SPECT)8. Slutligen, antikroppar kan också användas som theranostic agenter möjliggör stratifiering av patienter och respons övervakning för riktade terapier9. Därför, nya mAbs börjar spela en kritisk roll i cancer upptäckt, diagnos, och behandling.
Trots kritiska framsteg i utvecklingen och produktionen av nya och mycket specifika mAbs, diagnostiska och terapeutiska tillämpningar kan göras ineffektiva på grund av komplexiteten i tumör miljön. Antikropps interaktioner är beroende av vilken typ av epitop, dvs,om det är linjär eller överensstämande10. Förutom erkännandet av antigener, antikroppar måste övervinna naturliga barriärer såsom kärlväggar, basalmembran, och tumören stroma att nå målceller som uttrycker antigen. Antikroppar interagera med vävnaden inte bara genom variabeln fragment antigen binding (fab) domän utan också genom konstant kristallint fragment (FC) som ytterligare leder till off-site interaktioner11. Inriktning kompliceras också av det heterogena uttrycket av tumörmarkörer i hela tumören bulk och heterogenitet i tumör vaskularisering och lymfkärlen systemet12,13. Dessutom, tumören mikromiljö består av cancerassocierade fibroblaster som stöder tumörceller, tumör immunceller som hämmar anti-tumör immunreaktioner, och tumörendotelet som stöder transport av syre och näringsämnen, alla av som stör penetrationen, distributionen och tillgängligheten av antikroppsbaserade Therapeutics eller diagnostik. Sammantaget kan dessa överväganden begränsa terapeutisk eller diagnostisk effekt, minska behandlingssvaret, och kan resultera i tumör resistens.
Därför, för utveckling av effektiva antikroppsbaserade terapier och diagnostik, det är viktigt att bedöma biodistribution och interaktion av antikropp-baserade konjugatet inom tumören mikromiljö. För närvarande, i prekliniska studier, är markör uttryck i tumör forskningsmodeller analyseras ex vivo av immunofluorescens (om) färgning av tumör avsnitt14. Standard om färgning utförs med primära markör-specifika antikroppar som sedan markeras med sekundär överföras märkta antikroppar på ex vivo tumörvävnad skivor som har isolerats från djuret. Denna teknik belyser den statiska placeringen av markören vid tidpunkten för vävnadfixering och ger inte insikt i hur antikroppsbaserade Therapeutics eller diagnostik kan distribuera eller interagera i fysiologiska förhållanden. Molekylär avbildning av PET, SPECT, US och pa kan ge information om den antikroppskonjugerade kontrasten agent fördelningen i levande prekliniska modeller8,15. Eftersom dessa avbildningsmetoder är icke-invasiva, kan longitudinella studier utföras och tidskänsliga data kan samlas in med ett minimalt antal djur per grupp. Dessa icke-invasiva metoder för molekylär avbildning är dock inte tillräckligt känsliga och har inte tillräcklig upplösning för lokalisering av antikropps distribution på cellnivå. Dessutom kan de fysiska och biologiska egenskaperna hos den primära antikroppen ändras drastiskt genom konjugering av ett kontrastmedel16.
För att ta in vivo fysiologiska och patologiska tillstånd i beaktande av hur antikroppsbaserade Therapeutics och diagnostik samverkar i tumör miljön och för att få högupplöst cellulära och även sub-cellulära distribution profiler av icke-konjugerade antikroppar, föreslår vi en om-metod, som bedöms i vivo Immunofluorescenslokalisering (IVIL), där den antigen-specifika antikroppen injiceras intravenöst in vivo. Den antikroppsbaserade terapeutiska eller diagnostiska, fungerar som en primär antikropp, cirkulerar i funktionella blodkärl och binder till dess målprotein i mycket noggrann, levande tumör miljö. Efter isolering av in vivo-märkta tumörer med den primära antikroppen, en sekundär antikropp används för att lokalisera ackumulerade och balanserade antikroppar konjugat. Denna metod liknar en tidigare beskrivits om histologisk metod injicera Fluorescent märkt antikroppar17. Även här, användning av icke-konjugerade antikroppar undviker en potentiell förändring i biodistribution egenskaper induceras av antikropps modifiering. Dessutom undviker ex vivo applicering av fluorescerande sekundär antikropp en möjlig förlust av fluorescenssignal vid vävnads uppsamling och-bearbetning och ger amplifiering av fluorescenssignalintensitet. Vår märkningsmetod återspeglar in vivo biodistribution av antikroppsbaserade läkemedel och riktade medel och kan ge viktiga insikter för utvecklingen av nya diagnostiska och terapeutiska agenter.
Här beskriver vi två tillämpningar av IVIL-metoden som tillämpas i tidigare studier som undersöker bio distributionen och tillgängligheten av antikroppsbaserade kontrastmedel för molekylär avbildningsmetoder för bröstcancer detektion. För det första, bio distributionen av en antikropp-nära infraröd Dye konjugat (anti-B7-H3 antikropp bunden till Near Infrared fluorescens Dye, indocyaningrönt Green, B7-H3-ICG) och isotypen kontroll agent (ISO-ICG) för fluorescens och Fotoakustisk molekylär Imaging utforskas18. Det här programmets metod beskrivs i protokollet. Därefter kvantifieras bio distributions resultaten av en överensstämningsmässigt känslig antikropp till netrin-1, som vanligtvis inte är detekterbar med traditionell om avbildning, som används med ultraljud molekylär avbildning, och presenteras i representativa resultat19. Vid avslutningen av detta protokoll papper, bör läsarna känna sig bekväma att anta IVIL-metoden för sina egna antikroppsbaserade forskningsapplikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här metoden har flera kritiska steg och kräver potentiella ändringar för att säkerställa en lyckad implementering. För det första måste doseringen och tidpunkten för den intravenösa injektionen av antikroppar/antikroppar anpassas till den specifika appliceringen. Generellt, doser bör användas som är förenliga med hur antikropps konjugaten normalt kommer att användas, dvs, matchande doser av den terapeutiska antikroppen eller antikroppsbaserade kontrastmedel. Också, tidpunkten för insamlingen av mål…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Andrew Olson (Stanford neurovetenskap Microscopy service) för diskussioner och utrustning användning. Vi tackar Dr. Juergen K. Willmann för hans mentorskap. Denna studie stöddes av NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA118681 Training Grant (KEW) och NIH K99EB023279 (KEW). Stanford neurovetenskap Microscopy tjänsten stöddes av NIH NS069375.
Materials
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Recherche en cancérologie. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Recherche en cancérologie. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
