Vi præsenterer en protokol til at foretage dynamiske målinger af luftvejene flydende pH under tynde film betingelser ved hjælp af en plade-læser.
I de seneste år, betydningen af slimhinde overflade pH i luftvejene er blevet fremhævet ved sin evne til at regulere luftvejene overflade væske (ASL) hydrering, Slim viskositet og aktivitet af antimikrobielle peptider, nøgleparametre involveret i medfødte forsvar af Lungerne. Dette er af primær betydning i forbindelse med kroniske luftvejssygdomme såsom cystisk fibrose (CF), hvor disse parametre er dysregulerede. Mens forskellige grupper har studeret ASL pH både in vivo og in vitro, deres metoder rapporterer en relativt bred vifte af ASL pH værdier og selv modstridende resultater vedrørende eventuelle pH forskelle mellem ikke-CF og CF-celler. Desuden giver deres protokoller ikke altid nok detaljer for at sikre reproducerbarhed, de fleste er lav gennemløb og kræver dyrt udstyr eller specialiseret viden til at gennemføre, hvilket gør dem vanskelige at etablere i de fleste laboratorier. Her beskriver vi en semi-automatiseret fluorescerende plade læser assay, der gør det muligt for real-time måling af ASL pH under tynde film betingelser, der nærmere ligner in vivo situation. Denne teknik giver mulighed for stabile målinger i mange timer fra flere luftveje kulturer samtidig og, vigtigt, dynamiske ændringer i ASL pH som reaktion på agonister og hæmmere kan overvåges. For at opnå dette, er ASL af fuldt differentieret primære humane luftvejs epitelceller (hAECs) farvet natten over med en pH-følsom farve for at give mulighed for reabsorption af den overskydende væske for at sikre tynde film betingelser. Når Fluorescens er overvåget ved tilstedeværelse eller fravær af agonister, udføres pH-kalibrering på stedet for at korrigere for volumen-og farve koncentrationen. Den beskrevne metode giver de nødvendige kontroller til at lave stabile og reproducerbare ASL pH målinger, som i sidste ende kunne bruges som en Drug Discovery platform for personlig medicin, samt tilpasset til andre epitelial væv og eksperimentel inflammatoriske og/eller Host-pathogen modeller.
Luftvejene epitel er dækket af et tyndt (~ 10 μm) væske lag kaldet luftvejene overflade væske (ASL). Den sammensætning og dybde (hydrering) af denne ASL er stramt reguleret og kontrollerer effektiviteten af luftvejene clearance af mucociliær rulletrappe1,2,3,4. I de seneste år er betydningen af ASL H+/HCO3– indhold blevet demonstreret af forskellige grupper på grund af dens evne til at regulere ASL hydrering5, luftvejs betændelse6 og infektion7, 8 samt Slim viskositet8,9. Vigtigere er det, at selv om der findes nogle kontroverser, mange undersøgelser har rapporteret dysregulering af luftvejene pH i kroniske luftvejssygdomme som astma10,11,12, KOL11, bronkiectasis11, kronisk rhinosinuitis13,14 og cystisk fibrose (CF)5,9,15,16,17, som tyder på, at behandlinger, der genopretter ASL pH kunne være nyttigt at behandle flere typer af kroniske luftvejssygdomme. CF er den mest almindelige autosomale recessiv genetiske sygdom i kaukasiske populationer og skyldes mutationer i CF transmembran konduktans regulator (CFTR) gen. Dette gen koder en anion (HCO3– og CL–) kanal, der spiller en afgørende rolle i ion og flydende transport og homøostase på tværs af epitel18. Selv om CF er en multi-organ sygdom, lunge patologi er den vigtigste årsag til sygelighed og dødelighed19,20 og i betragtning af den primære defekt i CF er en nedsat transport af CL– og HCO3–, man kan hypotese, at ekstracellulærvæske pH hos mennesker med CF vil blive dysreguleret sammenlignet med personer, der ikke har CF. målingen af ASL pH har således været et aktuelt område inden for forskning i CF, og forskellige grupper har udviklet teknikker til at måle ASL pH i CF Airways.
In vivo, luftvejs pH er blevet målt ved hjælp af forskellige teknikker, fra mikro-sonder (fiber-optiske, guld eller mobidium prober)5,21,22,23,24 til pH målinger af eller udåndings ånde kondensat (EBC)10,11,12,25,26,27. På forskningsområdet for CF, pH er ved at blive udbredt undersøgt på grund af dens potentielle kliniske konsekvenser. Teoretisk, at gøre luftvejene mere alkalisk kunne øge bakteriel drab og forbedre mucociliær clearance og luftvejs homøostase som helhed. In vivo/ex vivo-undersøgelser rapporterer imidlertid en lang række pH-værdier, og til dato er resultaterne ikke entydige med hensyn til eksistensen af en forskel i pH-værdi mellem ikke-CF-og CF-Airways. I begyndelsen af 2000 ‘ erne rapporterede forskellige grupper pH i EBC. I ikke-syge grupper varierede pH-værdierne fra 4,6 til 8,5, men det var interessant, at EBC pH blev fundet mere surt under eksacerbationer hos personer med CF12,27. For nylig har in vivo målinger af ASL i humane og animalske modeller af CF rapporteret modstridende resultater16,17,21,22,23, 24 og det er stadig uklart, om CF Airways er mere sure end ikke-CF Airways.
Da in vivo måling af den nedre ASL pH har vist sig vanskelig på grund af den meget lille mængde væske foring luftvejene og potentiel tilstedeværelse af slim propper i sygdom, mange grupper har henvendt sig til in vitro eksperimenter til at måle ASL pH, hovedsagelig ved hjælp af tre forskellige Metoder. Den første metode anvender dextran-koblet celle-uigennemtrængelig pH-følsom fluorescerende farvestoffer, der tilsættes som et tørt pulver, enten direkte til ASL eller ved hjælp af en inaktiv væske kaldet perfluchlorcarbon (PFC)5,8,16 , 17 ud af , 28 stk. , 29 ud af , 30 stk. , 31 stk. , 32. denne teknik giver imidlertid ikke megen kontrol over den nøjagtige mængde farvestof, der tilsættes til kulturerne, og udgør en risiko for farvestof aggregater og store forskelle i koncentrationen mellem prøver og/eller eksperimenter og selv inden for samme prøve . Det er også generelt blevet udført med et confokal mikroskop, som begrænser dets anvendelighed og i mange tilfælde forhindrer detaljeret overvågning af flere prøver og ændringer i optagelsesforholdene. Den anden metode, der anvendes til at måle ASL pH, er brugen af ph-følsomme mikroelektroder5,15. ASL pH-målinger er derfor ikke afhængige af fluorescerende farvestof koncentration og bør give mere robuste og reproducerbare resultater. Denne metode giver dog ikke mulighed for dynamiske realtidsmålinger af ASL pH, og det er heller ikke let at foretage flere aflæsninger under forskellige forhold. Det er også en arbejdsintensiv, kompleks, proces, der kræver specialudstyr (mikroelektrode fabrikation/elektrofysiologiske optagelses anordninger) og uddannelse til indsamling af prøverne til efterfølgende pH-måling og kalibrering. Desuden har disse to teknikker også vist nogle uoverensstemmelser i evnen til at producere reproducerbare resultater: ved hjælp af den pH-følsomme fluorescerende farvestof metode, tang et al. rapporterede værdier på 7,35 for non-CF ASL og 7,0 for CF ASL8 , mens seneste papir fra samme gruppe, var ASL pH 6,9 og 6,4 for ikke-CF og CF, henholdsvis17. På samme måde gav mikroelektrode målinger værdier på 6,4 i non-CF ASL og 6,1 i CF ASL i en undersøgelse fra 200315 , hvorimod samme gruppe rapporterede værdier på 6,7 for ikke-CF asl og 6,45 for CF ASL i en undersøgelse fra 20135. Endelig, i den tredje metode, tilføjer forskerne en forholdsvis stor mængde af svagt bufferopløsning på den apikale (slimhinde) overflade af kulturerne, således at ødelægge tynde film betingelser og ændre ASL sammensætning, og potentielt dens regulering. pH måles derefter enten ved hjælp af ph-følsomme fluorescerende farvestoffer33, ved en pH-stat titrerings metode i et Ussing kammer13,14eller kræver, at den fortyndede ASL fjernes fra kulturerne og ph måles ved hjælp af en pH-værdi elektrode, analysator eller lakmus strimler34. Et andet problem i den nøjagtige måling af ASL pH er etableringen af en standardkurve, der er så præcis som muligt. Uanset om målingerne udføres med en elektrode, der måler forskellen i elektrisk potentiale via en harpiks eller anvender pH-følsomme fluorescerende farvestoffer, vil begge disse tilgange blive påvirket af det lokale mikromiljø af de prøver, der Målt. Mere specifikt kan dissociations konstanten (KD) af farvestofferne variere betydeligt afhængigt af temperatur, ionisk styrke, viskositet samt potentielle interaktioner af farvestoffet med cellulære bestanddele såsom proteiner og potentielt slim.
For at forsøge at overvinde mange af disse tekniske spørgsmål, samt at udvikle en mere dynamisk, enklere og højere gennemløb metode, har vi etableret en in vitro-teknik, der registrerer ASL pH i primære hAEC kulturer ved hjælp af en celle-uigennemtrængelig pH-følsom fluorescerende farvestof i en almindelig kommerciel plade læser. Metoden genererer reproducerbare, dynamiske, semi-automatiserede, real-time målinger af ASL pH af fuldt differentierede 3D cellekulturer under tynde film betingelser. Ved hjælp af en multiple-brønd plade læser, kan denne semi-automatiseret assay foretage nær samtidige målinger af pH for op til 24 betingelser over 12 h og kan overvåge virkningen af at tilføje forskellige agonister eller hæmmere. I dette dokument beskriver vi metoden i detaljer og rapporterer repræsentative resultater under positive og negative kontrolbetingelser, der validerer teknikken.
Her giver vi en detaljeret protokol for den dynamiske måling af ASL pH i primære humane luftveje epitelceller. Kritiske trin omfatter vask af slim fra den apiske overflade af cellerne, måling og subtraktion af baggrunden ved hjælp af de samme parametre som i forsøget, optimering z-position og opnå og udføre en in situ pH kalibrering.
Det første trin i vask af cellerne er afgørende som et tykt lag Slim kan (i) forhindre, at farvestofferne når periciliary Layer (PCL) og (II) forsinke eller forhindre påvisning af ændringer i fluorescens som reaktion på agonister/hæmmere. Vores metode blev udviklet for at undersøge, hvordan primære haecs modulede aktiviteten af HCO3– og H+ transportører som reaktion på agonister. Selv om det vil være interessant at undersøge, hvordan ændringer i PCL pH relaterer til ændringer i SLIM pH, yderligere udvikling af denne protokol er nødvendig, herunder brugen af forskellige molekylvægt-dextrans til differentielt målrette de 2 lag og z-scanninger gennem hele ASL.
Baggrunds måling er et andet vigtigt skridt i denne protokol. Den apiske overflade af fuldt differentieret Primærluft vejs epitel er sjældent helt flad, hvilket vil påvirke lysets vej og dermed baggrunden. Sikring af, at baggrunds aflæsninger udføres i de samme lokale punkter af brøndene som under forsøget er afgørende for reproducerbarhed og stabilitet af optagelserne.
Optimering af z-position og gevinst er nødvendige skridt, der skal sættes op for hver forskellige koncentration af fluorescerende farvestof, der vil blive anvendt. Dette vil forhindre høj Inter-eksperiment variation. Når det er oprettet, giver vores analyse stabile og reproducerbare resultater. En af grundene til dette er, at farvestofferne tilsættes på den apiske overflade på cellerne i en lille mængde væske, der let reabsorberes af epitel, og som efterlader en homogen mærket ASL. En anden metode til at plette ASL, der kan være lige så vellykket, brugt tørt pulver eller en “suspension” i PFC. selv om dette kan være tidsbesparende (da forsøgene normalt udføres inden for 2 timer), er det usandsynligt, at de tørre farvestoffer fuldt opløst i ASL og dermed kan formular klumper. Der findes således forskellige koncentrationer af pH-følsom farve på overfladen af epitel cellerne.
In situ-pH-kalibreringen er et vigtigt skridt for at opnå nøjagtige, reproducerbare resultater. Som vist og forklaret i resultatafsnittet vil forskelle i ASL-volumener påvirke fluorescens tællinger og dermed de interpolerede pH-værdier (figur 2 og figur 3). Mens forskellige grupper tidligere har offentliggjort ASL pH-målinger, er der opnået en lang række værdier, selv mellem forskellige undersøgelser offentliggjort af samme gruppe8,17. Vi mener, at resultaterne vil blive mere reproducerbare ved at udføre in situ-kalibreringer. Sammenlignet med andre pH-kalibrerings teknikker, som anvender den høje K+/nigericin (eller flere ionophores) metode til at generere standardkurven28,29,30, den analyse, der præsenteres her har den fordel, at , så længe hvert trin udføres i et sikkerhedskabinet, kan de celler, der anvendes til ASL pH, vaskes, opbevares og genbruges til andre forsøg, forudsat at de udførte behandlinger ikke uigenkaldeligt påvirker epitel cellerne.
Udviklingen og optimeringen af denne analyse har givet reproducerbare resultater, og vi mener, at denne metode vil hjælpe andre grupper med deres ASL pH-måling. Men denne teknik har også nogle begrænsninger som følge af opsætning og den type celler, der bruges. Overvågning af ASL pH over en længere periode end den, der præsenteres her (> 8-10 h) kan vise sig vanskelig, da et langsigtet højt fugtigheds miljø kan beskadige udstyret, og det faktum, at de fleste plade læsere kun giver mulighed for at registrere kinetiske aflæsninger over en Vis tid (typisk 24 timer). Anvendelse af fuldt differentierede primære haecs er afgørende i den måde, at forskellige faser af differentiering vil påvirke udtrykket af HCO3– og H+ transportører. Der er imidlertid stort set ingen mulighed for at kontrollere mængden af ASL præcist i celler, der dyrkes under tynde film. Som anført i protokollen og resultater sektioner, ændringer i volumen vil påvirke fluorescens ratio og det er desværre nødvendigt at antage, at i celler dyrket fra en enkelt person, seedede på samme dag på forskellige semi-permeable støtte, ASL mængder vil være den samme. Som følge af denne begrænsning vil enhver agonist eller hæmmer, der vil påvirke væske sekretionen eller absorptionen, påvirke ASL-volumenet og formodentlig fluorescens ratioer. Men i vores analyse udføres kalibreringskurven ved forsøgets afslutning, så vi kan antage, at disse ændringer i volumen vil påvirke kalibrerings forholdene på samme måde som under det kinetiske eksperiment. Af denne grund rådgiver vi grupper, der ville være interesseret i at udvikle denne analyse, at bruge mindst 2-3 replikater pr. betingelse testet, da dette vil give mulighed for etablering af en standardkurve for hver betingelse.
Her præsenterer vi en enkel, semi-automatiseret, assay, der tillader real-time måling af slimhinde overflade pH under tynde film betingelser. Det har kapacitet til at undersøge dynamiske pH-reaktioner i mange kulturer i en nær-samtidig måde, der giver mulighed for Inter-og intra-donor sammenligninger. Opskalering denne metode til en 96 brønd plade format ved hjælp af polariseret system (HTS 96 brønd plader)38 ville give endnu højere gennemløb som en Drug Discovery assay. Desuden har vi vist, hvordan denne teknik kan bruges til at studere den akutte virkning af agonister på ASL pH, og vi har allerede offentliggjort, at denne metode kan bruges til at studere den langsigtede virkning af en apikale protonpumpehæmmer på CF haecs ASL39. Som pH har vist sig at regulere infektion, betændelse, Slim viskositet og ion transport, identificere molekylære mål, der kan øge pH vil være værdifulde i forskningsområder af kroniske lungesygdomme og denne teknik vil potentielt lette udvikling af lægemiddel screening i personaliseret medicin tilgange. Endelig, da dysregulering i syre-base homøostase spiller en stor rolle i andre sygdomme, denne protokol kan tilpasses, med optimering trin, til forskellige udstyr (plade læsere) og celletyper, såsom andre epitelceller. Ekstracellulær surhedsgrad er karakteristisk for kræft40,41,42 og denne analyse kan hjælpe med at bestemme, hvordan solide tumorer producerer lav phe eller kan bruges som en lav-gennemløb Drug screening assay for genoprettelse af pH-homøostase. Tilsvarende, som for kroniske luftvejssygdomme, det kunne også give en platform for udvikling af en personlig medicin tilgang.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af to CF Trust Strategic Research Centre (SRC003 og SRC013) og et medicinsk Forskningsråd (MRC) tillid til Concept-tilskud (MC_PC_15030). JG blev støttet af et tilskud fra den medicinske forskningsfond (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB blev støttet af en medicinsk Forskningsråd kliniker Fellowship (MR/M008797/1). IH blev støttet af en Wellcome Trust klinisk uddannelse stipendium (203520/Z/16/Z). Forskningen blev støttet af det nationale Institut for sundhedsforskning Newcastle Biomedical Research Centre baseret på Newcastle hospitals NHS Foundation Trust og Newcastle University. De synspunkter, der udtrykkes er dem af forfatteren (r) og ikke nødvendigvis dem af NHS, NIHR eller Department of Health. Primære celler fra Dr. Randell blev støttet af Cystic Fibrosis Foundation Grant (BOUCHE15R0) og NIH Grant (P30DK065988).
0.2 µm syringe filter | Starlab | E4780-1226 | |
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3470 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
CFTRInh172 | RnD Systems (Tocris) | 3430 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM |
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran | ThermoFisher | D22910 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran | ThermoFisher | P10361 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
Forskolin | RnD Systems (Tocris) | 1099 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Cellstar | 655180 | |
Humidity cassette | TECAN | 30090495 | |
KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
MES | Sigma Aldrich | M3885 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
NaHepes | Sigma Aldrich | H3784 | |
Plate reader: TECAN SPARK 10M | TECAN | 30086375 | |
Tris | Sigma Aldrich | T1503 | |
Universal pH electrodes DJ 113 | VWR | 662-1385 |