Vi presenterer en protokoll for å gjøre dynamiske målinger av luftveiene overflaten flytende pH under tynne film forhold ved hjelp av en plate-leser.
I de senere årene har betydningen av slimhinne overflaten pH i luftveiene blitt fremhevet av dens evne til å regulere luftveiene overflate væske (ASL) hydrering, mucus viskositet og aktivitet av antimikrobielle peptider, viktige parametre involvert i medfødt forsvar av Lungene. Dette er av primær relevans på området kroniske luftveissykdommer som cystisk fibrose (CF) der disse parametrene er dysregulated. Mens ulike grupper har studert ASL pH både in vivo og in vitro, deres metoder rapporterer et relativt bredt spekter av ASL pH-verdier og til og med motstridende funn om eventuelle pH-forskjeller mellom ikke-CF og CF-celler. Videre deres protokoller ikke alltid gi nok detaljer for å sikre reproduserbarhet, de fleste er lav gjennomstrømning og krever dyrt utstyr eller spesialisert kunnskap til å gjennomføre, noe som gjør dem vanskelige å etablere i de fleste laboratorier. Her beskriver vi en semi-automatisert fluorescerende plate leser analysen som gjør det mulig for sanntids måling av ASL pH under tynne film forhold som nærmere likne in vivo situasjonen. Denne teknikken gjør det mulig for stabile målinger i mange timer fra flere luftveis kulturer samtidig, og enda viktigere, kan dynamiske endringer i ASL pH som svar på agonister og hemmere overvåkes. For å oppnå dette, ASL av fullt differensiert primære menneskelige luftveier epitelceller (hAECs) er beiset over natten med en pH-følsom fargestoff for å muliggjøre reabsorpsjon av overflødig væske for å sikre tynne film forhold. Etter fluorescens overvåkes i nærvær eller fravær av agonister, er pH kalibrering utføres in situ for å korrigere for volum og farge konsentrasjon. Metoden beskrevet gir de nødvendige kontrollene for å gjøre stabile og reproduserbar ASL pH målinger, som til slutt kunne brukes som et medikament funnet plattform for personlig medisin, samt tilpasset andre epitel vev og eksperimentelle forhold, for eksempel inflammatoriske og/eller Host-patogen modeller.
Luftveisepitel er dekket av en tynn (~ 10 μm) væske lag kalt luftveiene overflate væsken (ASL). Sammensetningen og dybden (hydrering) av denne ASL er strengt regulert og styrer effektiviteten av luftveis klaring ved mucociliary rulletrapp1,2,3,4. I de senere årene, betydningen av ASL H+/HCO3– innhold har blitt demonstrert av ulike grupper på grunn av sin evne til å regulere ASL hydration5, luftveiene betennelse6 og infeksjon7, 8 i tillegg til mucus viskositet8,9. Viktigere, selv om det finnes noen kontroverser, har mange studier rapportert feilregulering av luftveiene pH i kroniske luftveis sykdommer som astma10,11,12, KOLS11, bronkiektasi11, kronisk rhinosinusitis13,14 og cystisk fibrose (CF)5,9, 15,16,17, som tyder på at behandling som gjenoppretter ASL pH kan være nyttig å behandle flere typer kroniske luftveissykdommer. CF er den vanligste autosomal resessivt genetisk sykdom i kaukasiske populasjoner og skyldes mutasjoner i CF transmembrane konduktans regulator (CFTR) genet. Dette genet koder en anion (HCO3– og CL–) kanal som spiller en avgjørende rolle i ion og Fluid transport og homeostase over prolifererende18. Selv om CF er en multi-organ sykdom, er lunge patologi den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet19,20 og vurderer den primære feilen i CF er en svekket transport av CL– og HCO3–, man kan hypothesize at pH-ekstracellulære i mennesker med CF vil bli dysregulated sammenlignet med mennesker som ikke har CF. således har måling av ASL pH vært en aktuell del av CF-forskning og ulike grupper har utviklet teknikker for å måle ASL pH i CF Airways.
In vivo, luftveis pH er målt ved hjelp av ulike teknikker, fra mikro-sonder (fiberoptisk, gull eller mobidium sonder)5,21,22,23,24 til pH målinger av hoste materiale eller utåndet pusten kondensat (EBC)10,11,12,25,26,27. I forskningsfeltet i CF blir pH mye studert på grunn av dens potensielle kliniske implikasjoner. Teoretisk sett gjør luftveiene mer alkalisk kan øke bakteriell drap og forbedre mucociliary clearance og luftveiene homeostase som helhet. Men i vivo/ex vivo studier rapporterer et bredt spekter av pH-verdier, og hittil er resultatene ikke avgjørende om eksistensen av en forskjell i pH mellom ikke-CF og CF Airways. På begynnelsen av 2000-tallet, rapporterte ulike grupper pH i EBC. Inne ingen-syk holdene, pH verdier variert fra 4,6 å 8,5 bortsett fra interessant, EBC pH var grunnlegge flere syrlig i løpet av eksaserbasjoner inne folk med CF12,27. Mer nylig, in vivo målinger av ASL i mennesker og dyr modeller av CF har rapportert motstridende resultater16,17,21,22,23, 24 og det er fortsatt uklart om CF Airways er mer Sure enn ikke-CF Airways.
Som in vivo måling av lavere ASL pH har vist seg vanskelig på grunn av svært liten mengde væske lining luftveiene og potensielle tilstedeværelsen av mucus plugger i sykdom, har mange grupper slått til in vitro eksperimenter for å måle ASL pH, hovedsakelig ved hjelp av tre forskjellige Metoder. Den første tilnærmingen bruker dextran-kombinert Cell-impermeant pH-sensitive fluorescerende fargestoffer som er lagt til som et tørt pulver, enten direkte til ASL eller ved hjelp av en inert væske kalt perfluorocarbon (PFC)5,8,16 , 17 i , 28 flere , 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32. men, denne teknikken gir liten kontroll over den nøyaktige mengden av fargestoff som er lagt til kulturer og presenterer en risiko for fargestoff aggregater og store forskjeller i konsentrasjon mellom prøver og/eller eksperimenter og selv innenfor samme prøve . Det har også generelt vært utført med et konfokalmikroskopi mikroskop, som begrenser anvendelsen og i mange tilfeller, hindrer detaljert overvåking av flere prøver og endringer i opptaksforhold. Den andre metoden ansatt for å måle ASL pH er bruken av pH-sensitive microelectrodes. ASL pH målinger er derfor ikke avhengig av fluorescerende fargestoff konsentrasjon og bør gi mer robuste og reproduserbar resultater. Denne metoden tillater imidlertid ikke dynamisk sanntidsmålinger av ASL pH, og det er heller ikke enkelt å foreta flere avlesninger under forskjellige forhold. Det er også en arbeidsintensiv, kompleks prosess som krever spesialutstyr (microelectrode fabrikasjon/elektrofysiologisk opptaksenheter) og opplæring for innsamling av prøvene for påfølgende pH-måling og kalibrering. Videre har disse to teknikkene også vist noen uoverensstemmelser i evnen til å produsere reproduserbar resultater: ved hjelp av pH-sensitive fluorescerende Fargemetode, tang et al. rapporterte verdier av 7,35 for ikke-CF ASL og 7,0 for CF ASL8 , mens i en mer nyere papir fra samme gruppe, var ASL pH 6,9 og 6,4 for ikke-CF og CF, henholdsvis17. På en lignende måte, microelectrode målinger ga verdier av 6,4 i ikke-CF ASL og 6,1 i CF ASL i en studie fra 200315 , mens den samme gruppen rapporterte verdier av 6,7 for ikke-CF asl og 6,45 for CF ASL i en studie fra 20135. Til slutt, i den tredje tilnærmingen, forskere legge til et relativt stort volum av svakt bufret løsning på apikale (slimhinne) overflaten av kulturer, og dermed ødelegge tynne film forhold og endre ASL komposisjon, og potensielt dens regulering. pH blir så målt enten ved hjelp av pH-sensitive fluorescerende fargestoffer33, av en pH-stat titrering metode i en ussing kammer13,14, eller krever fortynnet ASL å bli fjernet fra kulturer og pH målt ved hjelp av en pH elektrode, analysator eller Litmus strimler34. En annen vanskelighet i nøyaktig måling av ASL pH er etablering av en standard kurve som er så presis som mulig. Faktisk, om målingene er utført med en elektrode som vil måle forskjellen i elektrisk potensial via en harpiks eller ved hjelp av pH-sensitive fluorescerende fargestoffer, vil begge disse tilnærmingene bli påvirket av den lokale mikromiljøet av prøvene blir Målt. Mer spesifikt, dissosiasjon konstant (KD) av fargestoffer kan variere betydelig avhengig av temperatur, ioniske styrke, viskositet samt potensielle interaksjoner av fargestoff med cellulære bestanddeler som proteiner og potensielt slim.
For å prøve å overvinne mange av disse tekniske problemene, samt å utvikle en mer dynamisk, enklere og høyere gjennomstrømming metoden, har vi etablert en in vitro teknikk som registrerer ASL pH i primære hAEC kulturer ved hjelp av en celle-impermeant pH-sensitive fluorescerende fargestoff i en standard kommersiell plate-leser. Metoden genererer reproduserbar, dynamisk, semi-automatisert, sanntidsmålinger av ASL pH i fullt differensiert 3D cellekulturer under tynne film forhold. Gjennom bruk av en fler brønn plate leser, dette semi-automatisert analysen kan gjøre nær samtidige målinger av pH for opptil 24 forhold over 12 h og kan overvåke effekten av å legge ulike agonister eller hemmere. I dette dokumentet beskriver vi metodikken i detalj og rapporterer representative resultater under positive og negative kontroll forhold som validerer teknikken.
Her gir vi en detaljert protokoll for dynamisk måling av ASL pH i primære menneskelige luftveier epitelceller. Kritiske skritt inkluderer å vaske mucus av apikale overflaten av cellene, måle og trekke bakgrunnen ved hjelp av de samme parametrene som i eksperimentet, optimalisere z-posisjon og få og utføre en in situ pH kalibrering.
Det første skrittet for å vaske cellene er avgjørende som et tykt lag av Slim kan (i) hindre at fargestoffer når periciliary laget (PCL) og (II) forsinke eller hindre påvisning av endringer i fluorescens som svar på agonister/hemmere. Vår metode ble utviklet for å studere hvordan primære hAECs modulert aktiviteten til HCO3– og H+ transportører i Response til agonister. Mens det vil være interessant å undersøke hvordan endringer i PCL pH knyttet til endringer i Slim pH, videre utvikling av denne protokollen er nødvendig, inkludert bruk av ulike molekylvekt-dextrans til differensielt målrette 2 lag og z-skanner gjennom hele ASL.
Bakgrunns måling er et annet viktig trinn i denne protokollen. Den apikale overflaten av fullt differensiert primærluft veiene prolifererende er sjelden helt flatt som vil påvirke lyset banen og derfor bakgrunnen. Sikre at bakgrunnen målingene er utført i de samme lokale punktene i brønnene som under eksperimentet er avgjørende for reproduserbarhet og stabilitet av opptakene.
Optimalisering av z-posisjon og gevinst er nødvendige skritt som må settes opp for hver annen konsentrasjon av fluorescerende fargestoff som skal brukes. Dette vil hindre høy variasjon i eksperimentet. Når satt opp, vår analysen gir stabile og reproduserbar resultater. En av grunnene til dette er at fargestoffer er lagt på apikale overflate på cellene i et lite volum av væske som er lett reabsorberes av epitel, etterlot en homogenously merket ASL. En annen metode for å flekk på ASL, som kan være like vellykket, brukes tørt pulver eller en “suspensjon” i PFC. selv om dette kan være tidsbesparende (som eksperimenter er vanligvis utføres innen 2 h), er det usannsynlig at de tørre fargestoffer fullt solubilize i ASL og dermed kan form klumper. Dermed ulike konsentrasjoner av pH-sensitive fargestoff vil bli funnet over overflaten av epitelceller.
PH-kalibreringen i situ er et viktig skritt for å oppnå nøyaktige, reproduserbar resultater. Som vist og forklart i resultatene delen, forskjeller i ASL volumer vil påvirke fluorescens teller og derfor interpolert pH-verdier (figur 2 og Figur 3). Mens ulike grupper har tidligere publisert ASL pH målinger, et bredt spekter av verdier har blitt innhentet selv mellom ulike studier utgitt av samme gruppe8,17. Vi tror at resultatene vil bli mer reproduserbar ved å utføre in situ kalibreringer. Sammenlignet med andre pH kalibrering teknikker, som bruker høy K+/nigericin (eller flere ionophores) metode for å generere standard Curve28,29,30, analysen presentert her har den fordelen at , så lenge hvert trinn er utført i et sikkerhetskabinett, kan cellene som brukes til ASL pH vaskes, oppbevares og gjenbrukes for andre eksperimenter, forutsatt at behandlingene som utføres ikke irreversibelt påvirker epitelcellene.
Utvikling og optimalisering av denne analysen har gitt reproduserbar resultater, og vi tror denne metoden vil hjelpe andre grupper med sin ASL pH-måling. Imidlertid har denne teknikken også noen begrensninger på grunn av oppsett og hvilken type celler som brukes. Overvåking ASL pH over en lengre tidsperiode enn det som presenteres her (> 8-10 h) kan vise seg å være vanskelig som en langsiktig høy luftfuktighet miljøet kan skade utstyret og det faktum at de fleste plate lesere bare tilbyr muligheten til å registrere kinetisk opplesninger over en viss tid (vanligvis 24 h). Bruk av fullt differensiert primære hAECs er avgjørende på den måten at ulike stadier av differensiering vil påvirke uttrykk for HCO3– og H+ transportører. Men det er nesten ingen mulighet til å presist kontrollere volumet av ASL i celler dyrket under tynne film forhold. Som det fremgår av protokollen og resultatene seksjoner, endringer i volumet vil påvirke fluorescens ratio og det er dessverre nødvendig å anta at i celler dyrket fra en enkelt person, seeded på samme dag på forskjellige semi-gjennomtrengelig støtter, ASL volumer vil være det samme. Som følge av denne begrensningen, vil enhver Agonistiske eller hemmer som vil påvirke væske sekresjon eller absorpsjon påvirke ASL volum og antagelig den fluorescens prosenter. Men i analysen vår, kalibreringen kurven er utført på slutten av eksperimentet, slik at vi kan anta at disse endringene i volum vil påvirke kalibrering prosenter på samme måte som under kinetisk eksperimentet. Av denne grunn anbefaler vi grupper som ville være interessert i å utvikle denne analysen, for å bruke minst 2-3 replikerer per tilstand testet da dette vil gi rom for etablering av en standard kurve for hver tilstand.
Her presenterer vi en enkel, semi-automatisert, analysen som gjør at sanntids måling av slimhinne overflaten pH under tynn-film forhold. Den har kapasitet til å undersøke dynamisk pH-respons i mange kulturer i en nesten samtidig måte som gjør at Inter-og intra-donor sammenligninger. Oppskalering denne metoden til en 96 brønn plateformat ved hjelp av polarisert system (HTS 96 brønn plater)38 ville gi enda høyere gjennomstrømning som et medikament Discovery analysen. Videre har vi vist hvordan denne teknikken kan brukes til å studere den akutte effekten av agonister på ASL pH og vi har allerede publisert at denne metoden kan brukes til å studere den langsiktige effekten av en apikale Proton pumpen inhibitor på CF hAECs ASL39. Som pH har vist å regulere smitte, betennelser, mucus viskositet og Ion transport, identifisere molekylære mål som kan øke pH vil være verdifullt i forskningen felt av kroniske lungesykdommer og denne teknikken vil potensielt lette utvikling av narkotika screening i personlig tilpasset medisin tilnærminger. Til slutt, siden feilregulering i syre-base homeostase spiller en stor rolle i andre sykdommer, kan denne protokollen tilpasses, med optimalisering trinn, til ulike utstyr (plate lesere) og celletyper, for eksempel andre epitelceller. Ekstracellulære Surhet er en karakteristisk for kreft40,41,42 og denne analysen kan bidra til å avgjøre hvordan solide svulster produsere lav pHe eller kan brukes som en lav-gjennomstrømning narkotika screening analysen for restaurering av pH homeostase. Tilsvarende, som for kroniske luftveissykdommer, det kan også gi en plattform for utvikling av en personlig medisin tilnærming.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av to CF Trust Strategic Research Center Grants (SRC003 og SRC013) og et medisinsk forskningsråd (MRC) tillit til Concept Grant (MC_PC_15030). JG ble støttet av et stipend fra Medical Research Foundation (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB ble støttet av en medisinsk forskningsråd terapeut forsker Fellowship (MR/M008797/1). IH ble støttet av en Wellcome tillit klinisk trening fellesskap (203520/Z/16/Z). Forskningen ble støttet av National Institute for Health Research Newcastle Biomedical Research Centre basert på Newcastle sykehus NHS Foundation Trust og Newcastle University. Synspunktene uttrykt er de av forfatteren (e) og ikke nødvendigvis de av NHS, NIHR eller Department of Health. Primær-celler fra Dr. Randell ble støttet av cystisk fibrose Foundation Grant (BOUCHE15R0) og NIH Grant (P30DK065988).
0.2 µm syringe filter | Starlab | E4780-1226 | |
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3470 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
CFTRInh172 | RnD Systems (Tocris) | 3430 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM |
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran | ThermoFisher | D22910 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran | ThermoFisher | P10361 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
Forskolin | RnD Systems (Tocris) | 1099 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Cellstar | 655180 | |
Humidity cassette | TECAN | 30090495 | |
KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
MES | Sigma Aldrich | M3885 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
NaHepes | Sigma Aldrich | H3784 | |
Plate reader: TECAN SPARK 10M | TECAN | 30086375 | |
Tris | Sigma Aldrich | T1503 | |
Universal pH electrodes DJ 113 | VWR | 662-1385 |