Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins
Summary
Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.
Abstract
Die umfangreiche Sequenzierung des gesamten Genoms hat viele Open Reading Frames (ORFs) identifiziert, die viele potenzielle Proteine liefern. Diese Proteine können wichtige Rollen für die Zelle spielen und neue zelluläre Prozesse entwirren. Unter den Proteinen sind Kiinasen wichtige Akteure, da sie zu Zellsignalwegen gehören und die Fähigkeit haben, viele Prozesse ein- oder auszuschalten, die für das Schicksal der Zelle entscheidend sind, wie Zellwachstum, Teilung, Differenzierung, Beweglichkeit und Tod.
In dieser Studie konzentrierten wir uns auf ein neues potenzielles Kinase-Protein, LIMK2-1. Wir haben seine Existenz durch Western Blot mit einem spezifischen Antikörper demonstriert. Wir haben seine Wechselwirkung mit einem vorgelagerten regulierenden Protein anhand von Coimmunopräzipitationsexperimenten bewertet. Coimmunoprecipitation ist eine sehr leistungsfähige Technik, die in der Lage ist, die Wechselwirkung zwischen zwei Zielproteinen zu erkennen. Es kann auch verwendet werden, um neue Partner eines Köderproteins zu erkennen. Das Köderprotein kann entweder über ein auf seine Sequenz konstruiertes Tag oder über einen Antikörper gereinigt werden, der speziell auf es abzielt. Diese Proteinkomplexe können dann durch SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidE Gel) getrennt und mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Immunpräzipitor LIMK2-1 wurde auch verwendet, um seine Kinase-Aktivität in vitro durch die ATP-Kennzeichnung zu testen. Dieser etablierte Assay kann viele verschiedene Substrate verwenden, und mutierte Versionen des Köders können verwendet werden, um die Rolle spezifischer Rückstände zu beurteilen. Die Wirkung pharmakologischer Wirkstoffe kann ebenfalls bewertet werden, da diese Technik sowohl hochsensibel als auch quantitativ ist. Dennoch erfordert die Behandlung von Radioaktivität besondere Vorsicht. Die Kinase-Aktivität kann auch mit spezifischen Antikörpern bewertet werden, die auf die Phosphogruppe der modifizierten Aminosäure abzielen. Diese Arten von Antikörpern sind nicht für alle phosphomodifizierten Rückstände kommerziell erhältlich.
Introduction
Seit vielen Jahrzehnten werden zahlreiche Signalwege aufgeklärt und ihre Beteiligung an entscheidenden zellulären Prozessen wie Zellteilung, Differenzierung, Beweglichkeit, programmiertem Zelltod, Immunität und Neurobiologie gezeigt. Kinasen spielen eine wichtige Rolle in diesen Signalwegen, da sie oft ihre Aktivierung oder Inaktivierung fein regulieren und Teil vorübergehender vielseitiger Komplexe sind, die auf äußere Reize reagieren1,2,3. Mutation und Dysregulation von Kiinasen führen oft zu Krankheiten beim Menschen, und sie sind daher zu einem der wichtigsten Drogenziele in den letzten vierzig Jahrengeworden 4.
In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Kinase-Wechselwirkung mit ihren vorgelagerten Regulatoren oder nachgelagerten Substraten erkennen zu können und neue Partner zu identifizieren. Affinitätsreinigung und Immunpräzipitation sind sehr leistungsfähige Techniken zur Isolierung von Proteinkomplexen5. Das Köderprotein oder die Ködernase kann mit einer bestimmten Peptidsequenz markiert werden, die die Verwendung von kommerziellen Perlen kovalent gekoppelt mit Antikörpern ermöglicht, die auf das Peptid abzielen. Dieses Material ermöglicht eine hohe Reproduzierbarkeit in den Experimenten6,7,8. Endogene Proteine können auch mit Antikörpern immunpräzipiert werden, die direkt auf das Köderprotein abzielen. Die Antikörper können mit Protein A oder Protein G Agarose Perlen vernetzt oder einfach mit diesen Perlen vor der Zugabe von Lysat inkubiert werden. Lysepuffer müssen optimiert werden, um eine Proteinlösung ohne Wechselwirkung zu ermöglichen und den Proteinabbau zu vermeiden. Ein großer Nachteil dieses Ansatzes ist, dass die Wechselwirkung bei der Zelllyse erkannt wird; daher können vorübergehende oder schwache Wechselwirkungen zusammen mit solchen, die einen subzellulären Kontext erfordern, übersehen werden. Andere Techniken können verwendet werden, um direkt in der Zelle zu arbeiten, wie Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) oder Förster Resonance Energy Transfer (FRET)11,12. Darüber hinaus ist die Immunpräzipitation nicht geeignet, die thermodynamischen Konstanten der Bindung zu bestimmen, für die physikalische Techniken wie Surface Plasmon Resonance, Isothermale Titrationskalorimetrie oder Mikroskalige Thermophorese erforderlich sind. 13,14.
Die Kinase-Aktivität kann mit mehreren Techniken bewertet werden. Dabei konzentrierten wir uns auf phosphospezifische Antikörperund in vitro-ATP-Etikettierung (Adenosin-TriPhosphat). Phosphospezifische Antikörper zielen auf die Phosphatmodifikation eines bestimmten Rückstands innerhalb eines Proteins ab. Sie können in Western Blot oder ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) nach der Zelllyse, für die Immunhistochemie und auch auf intakten Zellen mit Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenz verwendet werden. Ihre Nachteile können ihr Mangel an Spezifität sein, die mit einer mutierten Version des Zielproteins bewertet werden kann, und sie sind nicht kommerziell für alle Proteine verfügbar. Die In-vitro-ATP-Kennzeichnung ist eine sehr robuste, etablierte und hochempfindliche Methode15. Immunpräzipierte oder rekombinante Proteine können verwendet werden, und verschiedene Substrate können getestet werden. Die Wirkung von Arzneimitteln kann auch bewertet werden, da diese Methode quantitativ ist. Sein Hauptnachteil ist, dass die Radioaktivität, die mit dem Ansatz verbunden ist, einen vorsichtigen Umgang erfordert. Alternative Methoden sind auch möglich, basierend auf der Messung von fluoreszierenden oder lumineszierenden Peptidsubstraten und unter Ausnutzung veränderter fluoreszierender/lumineszierender Eigenschaften bei phosphorylierter Phosphorylierung. Solche Methoden ermöglichen auch einen hohen Durchsatz, der z. B. beim Screening von Molekülen erforderlich ist, die potenzielle Inhibitoren der Zielkinase sein können. Tatsächlich stellen Kinasen eine der größten Klassen von Arzneimittelzielen dar, die von Pharmaunternehmen verfolgt werden16.
In dieser Studie konzentrierten wir uns auf das LIMK2-1 Protein (LIMK2-1 steht für Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Das LIMK2-Kinase-Protein wurde erstmals1995 17 beschrieben. Durch alternatives Spleißen werden drei Isoformen von LIMK2 hergestellt: LIMK2a, LIMK2b und LIMK2-1. Derzeit wurde LIMK2-1 nur auf mRNA-Ebene in einer einzigen Studie18beschrieben. Hierbei charakterisieren wir dieses potentielle neue Kinase-Protein auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen. Erstens zeigen wir, dass LIMK2-1 tatsächlich synthetisiert ist. Ähnlich wie seine beiden Pendants LIMK2a und LIMK2b interagiert es mit der vorgelagerten Kinase ROCK (Rho-assoziierte Proteinkinase). Wir zeigen, dass LIMK2-1 eine Kinase-Aktivität auf Myelin Basic Protein (MBP) hat, aber nicht auf Cofilin, dem kanonischen Substrat von LIM-Kinasen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierbei haben wir robuste biochemische Werkzeuge eingesetzt, um auf molekularer Ebene ein neues Protein, LIMK2-1, zu charakterisieren, von dem angenommen wird, dass es sich um eine Kinase handelt, die auf ihrer Sequenz und ihren Homologen LIMK2a und LIMK2b20basiert.
Erstens haben wir die Existenz von LIMK2-1 auf Proteinebene anhand der Western Blot-Analyse mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen. Anschließend evaluierten wir seine Wechselwirkung mit der vorgela…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von La Ligue contre le Cancer, l’Association Neurofibromatoses et Recklinghausen und la Région Centre Val de Loire. Vielen Dank an Aurélie Cosson und Déborah Casas für Flow-Zytometrie-Daten und an Keyron Hickman-Lewis für das gründliche Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
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