새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화
Summary
우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.
Abstract
광범위한 전체 게놈 시퀀싱은 많은 잠재적 단백질을 제공하는 많은 오픈 판독 프레임(ORFs)을 확인했습니다. 이 단백질은 세포를 위한 중요한 역할을 할 수 있고 새로운 세포 프로세스를 해명할 수 있습니다. 단백질 중, 키나아제는 세포 신호 통로에 속하고 세포 성장, 분열, 분화, 운동성 및 죽음과 같은 세포의 운명에 중요한 많은 프로세스를 켜거나 끄는 능력을 가진 주요 배우입니다.
본 연구에서는 새로운 잠재적 키나아제 단백질LIMK2-1에 초점을 맞추게 되었습니다. 우리는 특정 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 그것의 존재를 입증했습니다. 우리는 coimmunocipation 실험을 사용하여 상류 조절 단백질과의 상호 작용을 평가했습니다. 동면역침전은 두 표적 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있는 매우 강력한 기술이다. 그것은 또한 미끼 단백질의 새로운 파트너를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 미끼 단백질은 그것의 서열에 설계된 꼬리표를 통해서 또는 항체를 통해서 구체적으로 그것을 표적으로 하기 위하여 정제될 수 있습니다. 이들 단백질 복합체는 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔)에 의해 분리되고 질량 분석법을 사용하여 확인될 수 있다. 면역침전성 LIMK2-1은 또한γ[32P] ATP 라벨링에 의해 시험관내에서의 키나아제 활성을 시험하기 위해 사용되었다. 이러한 잘 확립된 분석기는 많은 상이한 기판을 사용할 수 있고, 미끼의 돌연변이 된 버전은 특정 잔기의 역할을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 매우 민감하고 정량적이기 때문에 약리학적 제제의 효과도 평가될 수 있다. 그럼에도 불구하고 방사능 처리에는 특별한 주의가 필요합니다. 키나아제 활성은 또한 변형된 아미노산의 인포 군을 표적화하는 특이적 항체로 평가될 수 있다. 이러한 종류의 항체는 모든 인광 변형 잔기에서 시판되지 않는다.
Introduction
수십 년 동안, 수많은 신호 경로 해명 되었습니다 및 세포 분열 등 중요 한 세포 프로세스에 그들의 참여, 분화, 운동성, 프로그램된 세포 죽음, 면역 및 신경 생물학, 표시 되었습니다. 키나아제는 종종 그들의 활성화 또는 불활성화를 미세하게 조절하고 외부 자극1,2,3에반응하는 일시적인 다목적 복합체의 일부이기 때문에 이러한 신호 경로에서 중요한 역할을 한다. 키나아제의 돌연변이 및 dysregulation는 수시로 인간에 있는 질병으로 이끌어 내고, 그러므로 과거40 년 4.
이러한 맥락에서, 그들의 업스트림 레귤레이터 또는 다운스트림 기판과의 키나제 상호 작용을 감지하고 새로운 파트너를 식별할 수 있어야 합니다. 친화성 정제 및 면역 침전은 단백질 복합체의 분리를위한 매우 강력한 기술5. 상기 미끼 단백질 또는 키나아제는 펩티드를 표적화하는 항체와 공유하여 상업적인 비드의 사용을 허용하는 특이적 펩티드 서열로 태그화될 수 있다. 이 물질은 실험 6,7,8에서높은 재현성을 허용한다. 내인성 단백질은 또한 미끼 단백질을 직접 표적화하는 항체를 사용하여 면역침전될 수 있다. 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 아가로즈 비드에 가교또는 단순히 용해액을 추가하기 전에 이들 비드로 배양될 수 있다. 용해 완충제는 상호 작용을 잃지 않고 단백질 용해를 허용하고 단백질 분해를 피하기 위해 최적화되어야합니다. 이 접근의 중요한 결점은 상호 작용이 세포 lysis에 검출된다는 것입니다; 따라서, 과도 또는 약한 상호 작용, 세포 외 컨텍스트를 필요로 하는 그들과 함께 놓칠 수 있습니다. 다른 기술은 근접 결선 분석 (PLA) 9, 생체 간연결 보조 친화 정화 (XAP)10,생물 발광 공명 에너지 전송 (BRET) 또는 Förster 공명 에너지와 같은 세포에서 직접 작동하도록 사용될 수있다 전송 (FRET)11,12. 또한, 면역 침전은 표면 플라스몬 공명, 등온 적정 열량 열량 계열 계열 또는 마이크로 스케일 열열염과 같은 물리적 기술이 필요한 결합의 열역학 상수를 결정하는 데 적합하지 않습니다. 13,14.
키나아제 활성은 여러 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 본 명세서에서, 우리는 인광 특이적 항체 및시험관 내 γ[32 P] ATP(아데노신 트리포스페이트) 라벨링에 초점을 맞췄다. 인광 특이적 항체는 단백질 내의 특정 잔기의 인산염 변형을 표적으로 한다. 그(것)들은 세포 용해 후에 서쪽 Blot 또는 ELISA (효소 연결된 면역흡착 분석) 면역물분석, 및 유세포 측정 또는 면역 형광을 사용하여 온전한 세포에 사용될 수 있습니다. 그들의 단점은 표적 단백질의 돌연변이 버전을 사용하여 평가될 수 있는 특이성의 그들의 부족을 포함할 수 있고, 그들의 그들의 모든 단백질에 대해 상업적으로 이용가능하지 않다. 시험관내γ[32P] ATP 라벨링은 매우 견고하고, 잘 확립되고, 매우 민감한 방법15이다. 면역침전성 또는 재조합 단백질이 사용될 수 있고, 상이한 기질이 시험될 수 있다. 약물의 효과 또한이 방법은 정량으로 평가 될 수 있습니다. 주요 단점은 접근 방식과 관련된 방사능에 주의해서 처리해야 한다는 것입니다. 형광 또는 발광 펩타이드 기질의 측정과 인산화 시 변경된 형광/발광 특성을 활용하는 대체 방법도 가능합니다. 이러한 방법은 또한 표적 키나아제의 잠재적 억제제일 수 있는 분자의 스크리닝에서 요구되는 높은 처리량을 허용한다. 실제로, 키나제는 제약 회사가 추구하는 가장 큰 약물 표적 군수 중 하나를 나타냅니다16.
본 연구에서, 우리는 LIMK2-1 단백질에 초점을 맞췄다(LIMK2-1은 Lin11, Isle1, Mec3 키나아제 이소폼 2-1을 의미합니다). LIMK2 키나아제 단백질은 1995년17년에처음 기술되었다. LIMK2의 세 가지 이소폼은 LIMK2a, LIMK2b 및 LIMK2-1의 대체 접합에 의해 생성됩니다. 현재, LIMK2-1은 단일 연구18에서mRNA 수준에서만 기재되어 있다. 본 명세서에서, 우리는 강력한 생화학적 접근법을 사용하여 분자 수준에서 이러한 잠재적인 새로운 키나아제 단백질을 특성화한다. 첫째, 우리는 LIMK2-1이 실제로 합성된다는 것을 보여줍니다. 그것의 2개의 대응과 유사하게, LIMK2a 및 LIMK2b는, 상류 키나아제 ROCK (로-관련 단백질 키나아제)와 상호 작용한다. LIMK2-1은 미엘린 염단백질(MBP)에 키나아제 활성을 가지고 있지만, LIM 키나아제의 정식 기질인 코필린에는 적용되지 않는다는 것을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 명세서에서, 우리는 분자 수준에서 새로운 단백질, LIMK2-1을 특성화하기 위해 강력한 생화학 적 도구를 사용하였으며, 그 서열및 그 상동체, LIMK2a 및 LIMK2b20에기초하여 키나아제인 것으로 여겨진다.
첫째, 우리는 특정 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 수준에서 LIMK2-1의 존재를 입증했습니다. 그 후 LIMK2a와 LIMK2b, LIMK2-1의 상동체를 조절하?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 라 리그 콘트레 르 암, l’협회 신경 섬유종 에 레클링하우젠, 라 레지온 센터 발 드 루아르에 의해 지원되었다. 유세포 측정 데이터에 대한 오렐리 코슨과 데보라 카사스, 그리고 원고의 철저한 교정을 위해 키론 히크먼-루이스에게 많은 감사를 드립니다.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neurosciences. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
