माउस हार्ट फील्ड-विशिष्ट कार्डिएक संतति कोशिकाओं की विट्रो जनरेशन में
Summary
इस विधि का उद्देश्य संतान कोशिका विनिर्देश और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए, और हृदय रोग मॉडलिंग के लिए कक्ष विशिष्ट हृदय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो में हृदय क्षेत्र-विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं को उत्पन्न करना है।
Abstract
Pluripotent स्टेम सेल दिल के विकास और रोग को समझने के लिए और पुनर्योजी दवा के लिए महान क्षमता प्रदान करते हैं. जबकि विकास कार्डियोलॉजी में हाल ही में प्रगति pluripotent स्टेम कोशिकाओं से हृदय कोशिकाओं को पैदा करने के लिए नेतृत्व किया है, यह स्पष्ट नहीं है अगर दो हृदय क्षेत्रों – पहले और दूसरे हृदय क्षेत्रों (FHF और SHF) – pluripotent स्टेम सेल सिस्टम में प्रेरित कर रहे हैं. इस पर ध्यान देने के लिए, हमने इन विट्रो विनिर्देश और हृदय क्षेत्र-विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल उत्पन्न किया। हम भ्रूण स्टेम कोशिकाओं Hcn4-GFP और Tbx1-Cre ले जाने लाइनों का इस्तेमाल किया; रोजा-आरएफपी एफएचएफ और एसएचएफ के पत्रकारों, क्रमशः, और कोशिका झिल्ली प्रोटीन Cxcr4, एक SHF मार्कर के लाइव सेल इम्यूनोस्टेनिंग। इस दृष्टिकोण के साथ, हम जनक कोशिकाओं जो कार्यात्मक गुण और उनके vivo समकक्षों में की transcriptome recapitulate उत्पन्न. हमारे प्रोटोकॉल जल्दी विनिर्देश और दो हृदय क्षेत्रों के अलगाव का अध्ययन करने के लिए और हृदय रोग मॉडलिंग के लिए कक्ष विशेष हृदय कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. चूंकि यह एक इन विट्रो organoid प्रणाली है, यह सटीक शारीरिक जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं. हालांकि, इस प्रणाली gastrulation चरण भ्रूण की गरीब पहुंच पर काबू पाने और उच्च throughput स्क्रीन के लिए upscaleकिया जा सकता है.
Introduction
pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) के उपयोग रोग मॉडलिंग और दवा उपचार1,2,3, के लिए रोगी विशेष मायोसाइट्स के साथ हृदय पुनर्जनन और व्यक्तिगत चिकित्सा के क्षेत्र में क्रांति ला दी है 4. हाल ही में, एट्रियल बनाम वेंट्रिकुलर के साथ-साथ पेसमेकर जैसे पीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के उत्पादन के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल में5,6 विकसित किए गएहैं. हालांकि, हृदय विकास का अध्ययन करने और बाद में वेंट्रिकुलर चैम्बर-विशिष्ट हृदय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कार्डियोजेनेसिस को इन विट्रो में फिर से बनाया जा सकता है या नहीं, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है।
प्रारंभिक भ्रूण ीय विकास के दौरान, बीएमपी 4, Wnts और Activin एक रूप आदिम लकीर7के रूप में स्रावित morphogens के प्रभाव में मध्यचर्मी कोशिकाओं . कार्डिएक मध्यचर्म कोशिकाओं Mesp1 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित, पूर्वकाल और बाद में स्थानांतरित करने के लिए हृदय वर्धमान और फिर आदिम हृदय ट्यूब7,8. कोशिकाओं के इस प्रवासी समूह में हृदय जनक कोशिकाओं (सीपीसी) की दो बहुत अलग जनसंख्या एंकुलेशन शामिल हैं , अर्थात् पहला और दूसरा हृदय क्षेत्र (एफएचएफ और एसएचएफ )9,10. SHF से कोशिकाओं अत्यधिक proliferative और प्रवासी हैं और मुख्य रूप से दिल ट्यूब के दीर्घीकरण और पाशन के लिए जिम्मेदार हैं. इसके अतिरिक्त, SHF कोशिकाओं कार्डियोमायोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं के लिए अंतर के रूप में वे दिल की ट्यूब में प्रवेश करने के लिए सही वेंट्रिकल, सही वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ और दोनों atria के बड़े हिस्से के फार्म7,10. इसके विपरीत, एफएचएफ कोशिकाएं कम प्रोलफेटिव और प्रवासी होती हैं और मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स में अंतर करते हैं क्योंकि वे बाएं वेंट्रिकल और एट्रिया11के एक छोटे भाग को जन्म देती हैं। इसके अलावा, SHF संतति Tbx1, FGF8, FGF10 और Six2 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, जबकि FHF कोशिकाओं Hcn4 और Tbx511व्यक्त ,12,13,14,15.
पीएससी सभी तीन रोगाणु परतों में अंतर कर सकता है और बाद में शरीर4,16में किसी भी कोशिका प्रकार में अंतर कर सकता है . इसलिए, वे हृदय के विकास को समझने और जन्मजात हृदय रोग के परिणामस्वरूप विशिष्ट विकासात्मकदोषों को मॉडलिंग करने के लिए जबरदस्त क्षमता प्रदान करते हैं, जो जन्म दोष 17 का सबसे अधिक कारण है। जन्मजात हृदय रोग के एक बड़े उपसमूह कक्ष-विशिष्ट हृदय असामान्यताओं18,19शामिल हैं. हालांकि, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि क्या ये असंगत हृदय क्षेत्र विकास से उत्पन्न होते हैं। इसके अलावा, जन्म के बाद कार्डियोमायोसाइट्स की गति बढ़ने में असमर्थता को देखते हुए हृदय पुनर्जनन1,7,20के लिए हृदय ऊतक बनाने के व्यापक प्रयास किए गए हैं. हृदय कक्षों के बीच शारीरिक और रूपात्मक मतभेदों को ध्यान में रखते हुए, पीएससी का उपयोग कर के कक्ष-विशिष्ट हृदय ऊतक की पीढ़ी महत्वपूर्ण महत्व की है। हालांकि विकास कार्डियोलॉजी में हाल ही में प्रगति पीएससी से हृदय कोशिकाओं की मजबूत पीढ़ी के लिए नेतृत्व किया है, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है अगर दो हृदय क्षेत्रों पीएससी प्रणालियों में प्रेरित किया जा सकता है.
विट्रो में कार्डियोजेनेसिस को पुन: प्राप्त करने और सीपीसी के विनिर्देश और गुणों का अध्ययन करने के लिए, हमने पहले पीएससी व्युत्पन्न कार्डियक स्फीरोइड21,22,23,24के आधार पर एक प्रणाली का उपयोग किया। हाल ही में, हम उत्पन्न माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (MESCs) GFP और RFP पत्रकारों के साथ FHF जीन Hcn4 और SHF जीन Tbx1 के नियंत्रण में, क्रमशः (mESCsTbx1-Cre; रोजा-आरएफपी; HCN4-GFP) 25| इन विट्रो विभेदित एमईएससी में कार्डियक गोलोइड ्स्ड होते हैं, जिनमें जीएफपी+ और आरएफपी+ कोशिकाएं मेसोडरमल कोशिकाओं के दो अलग-अलग क्षेत्रों से प्रकट होती हैं और पूरक तरीके से पैटर्न होती हैं। परिणामस्वरूप GFP + और आरएफपी + कोशिकाओं FHF और SHF विशेषताओं का प्रदर्शन किया, क्रमशः, आरएनए अनुक्रमण और क्लोनल विश्लेषण द्वारा निर्धारित. महत्वपूर्ण बात, Isl1-RFP रिपोर्टर (mESCIsl1-RFP)ले जाने mESCs का उपयोग कर, हमने पाया कि SHF कोशिकाओं ईमानदारी से सेल सतह प्रोटीन CXCR4 द्वारा चिह्नित किया गया, और यह transgenes के बिना दिल क्षेत्र-विशिष्ट कोशिकाओं के अलगाव सक्षम कर सकते हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल एमईएससी से दिल क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी की पीढ़ी और अलगाव का वर्णन करेगा, जो चैम्बर-विशिष्ट हृदय रोग के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में काम कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे प्रोटोकॉल में, हम कार्डियक अफ़ीरॉइड और अलग दिल क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। उन सीपीसी विनिर्देश और उनके गुणों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल क…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ई. टी जादू कि मामलों और AHA द्वारा समर्थित था. C. K. NICHD/NIH (R01HD086026), AHA, और एमएससीआरएफ से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
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